超声辅助萃取六味地黄丸中没食子酸工艺优化

周大学 骆小方 任邦春 潘峰

摘要 采用超声辅助萃取法从六味地黄丸中提取没食子酸，考察溶剂比例（甲醇∶0.1%乙酸）、超声温度、超声时间和超声功率对六味地黄丸中没食子酸提取率的影响，通过单因素试验和正交试验研究六味地黄丸中没食子酸超声辅助萃取法的最佳工艺条件。结果表明，六味地黄丸中没食子酸的最佳工艺条件为溶剂比例（甲醇∶0.1%乙酸）2∶8、超声温度40 ℃、超声时间30 min、超声功率180 W。没食子酸在1.6～19.2 μg/mL线性关系良好（R2=0.999），平均加标回收率为99.3%，相对标准偏差（RSD）为2.5%（n=3）。超声辅助萃取法与浸渍提取法相比，提取没食子酸含量增加了17.14%～23.62%。

关键词 超声辅助萃取;六味地黄丸;没食子酸;工艺优化;高效液相色谱

中图分类号 R-284  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）12-0190-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.049

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction Process of Gallic Acid from Liuwei Dihuang Pills

ZHOU Da xue1，LUO Xiao fang2，REN Bang chun3 et al （1.Biomedical Analysis Center，Army Medical University，Chongqing Key Laboratory of Cytology，Chongqing 400038;2.Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection，Chongqing 401121;3.The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010）

Abstract Ultrasound assisted extraction method was used to extract gallic acid from Liuwei Dihuang Pills，and the effects of solvent ratio （methanol∶0.1% acetic acid），ultrasonic temperature，ultrasonic time and ultrasonic power on the extraction rate of gallic acid in Liuwei Dihuang Pills were investigated.The optimal technological conditions of gallic acid in Liuwei Dihuang Pills were studied by single factor experiment and orthogonal experiment.The results showed that the optimal process conditions for the ultrasonic assisted extraction of gallic acid in Liuwei Dihuang Pills were as follows：solvent ratio 2∶8，ultrasonic temperature 40 ℃，ultrasonic time 30 min and the ultrasonic power 180 W.Gallic acid had a good linear relationship in the range of 1.6-19.2 μg/mL （R2=0.999），the average recovery rate was 99.3%，and the relative standard deviation （RSD） was 2.5% （n=3）.Compared with the impregnation method，the content of gallic acid extracted by ultrasonic assisted extraction increased by 17.14%-23.62%.

Key words Ultrasonic assisted extraction method;Liuwei Dihuang Pills;Gallic acid;Process optimization;HPLC

六味地黃丸由北宋名医钱乙所创，主要成分为熟地黄、山药、山茱萸、杜丹皮、茯苓、泽泻6味中药，主要用于阴液亏损引发的各种病症，如头晕耳鸣、腰膝酸软、盗汗遗精、骨蒸潮热和消渴（糖尿病）等。没食子酸为山茱萸中的有机酸，具有抗菌、抗病毒和抑制淋巴细胞转化的作用[1]，还可以通过抑制内皮NO的生成诱导血管内皮依赖性收缩和松弛[2]。

没食子酸的提取方法主要有索氏提取法[3]、回流法[4]、超声法[5]、离子萃取法[6]、浸渍法[7]、酸水解法[8]、碱水解法[9]、发酵法[10]、酶法[11]等。其中，索氏提取法、回流法、浸渍法时间较长;离子萃取法温度较高，对产物活性不好;酸水解法、碱水解法、发酵法、酶法工序复杂，不利于操作。因此研究超声辅助萃取法，通过超声波增大分子运动速度和穿透力，促进提取物溶解，加速提取进程。笔者通过单因素试验和正交试验研究溶剂比例、超声温度、超声时间和超声功率对没食子酸提取量的影响，以期研究六味地黄丸中没食子酸提取的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪（美国，Waters公司）;KQ-250E型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）;MSU电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 试剂 甲醇为色谱纯（美国Fisher公司），其余试剂均为分析纯;超纯水由Millipore纯水仪（美国Millipore公司）制备;没食子酸（C7H6O5）对照品（中国医药（集团）上海化学试剂公司）;六味地黄丸样品（太极集团重庆桐君阁药厂有限公司）。

1.3  溶液制备

1.3.1 对照品溶液制备。精密称取没食子酸对照品10.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀，得到400 μg/mL的标准液，用移液枪分别吸取此标准液0.1、0.3、0.6、0.9、1.2 mL，置于25 mL容量瓶中，加流动相至刻度，得到浓度为1.6、4.8、9.6、14.4、19.2 μg/mL的标准系列。

1.3.2 样品溶液制备。准确称取样品1.0 g于100 mL具塞三角瓶中，加入溶剂50 mL（流动相），在温度40 ℃、超声功率180 W的条件下超声30 min，用流动相补足减失的重量，摇匀，过0.45 μm滤膜，即得样品待测液。

1.4 色谱条件

色谱柱为SunFire C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），流动相为甲醇-0.1%乙酸溶液（2∶8，V/V），流速为1 mL/min，检测波长为273 nm，理论塔板数以没食子酸计算，不低于4 000。

1.5 单因素试验和正交试验

以单因素试验优化没食子酸的提取条件，并根据L9（34）正交试验（表1）和极差分析考察溶剂比例（甲醇∶0.1%乙酸）、超声温度、超声时间和超声功率对没食子酸提取量的影响。

2 结果与分析

2.1 单因素试验 准确称取同一批样品1.0 g，分别研究溶剂比例（甲醇∶0.1%乙酸）、超声温度、超声时间和超声功率对六味地黄丸中没食子酸提取量的影响，结果见表2。

2.2 正交试验

在单因素试验基础上，根据L9（34）正交试验考察溶剂比例（A）、超声温度（B）、超声时间（C）、超声功率（D）这4个因素对没食子酸提取量的影响，结果见表3。从表3可以看出，影响没食子酸提取效果大小的主次因素为A>B>C>D，正交试验确定的最优组合条件为A1B2C3D3，即溶剂比例（甲醇∶0.1%乙酸）2∶8、超声温度40 ℃、超声时间30 min、超声功率180 W。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系。精密吸取对照品溶液，在波长273 nm处

测定峰面积。以对照品溶液浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，求得回归方程为Y=59 751X+31 715（R2=0.999），结果表明没食子酸浓度在1.6～19.2 μg/mL呈良好的线性关系（图1）。

2.3.2 重复性试验。准确称取同一批样品1.0 g，共5份，按“1.3.2”的方法处理样品，按“1.4”色谱条件测定没食子酸的含量，结果分别为0.973 6、1.012 9、0.985 2、1.038 6、0.995 7 mg/g，RSD为2.5%，说明该方法重复性好。

2.3.3 加标回收率试验。精密称取已知含量的同一批样品1.0 g，共3份，分别加入0.2 mg没食子酸对照品，按“1.3.2”的方法处理样品，按“1.4”色谱条件测定。由表4可知，没食子酸回收率为94.5%～104.1%，回收率较高，可用于六味地黄丸中没食子酸含量的测定。

2.4 六味地黄丸中没食子酸含量测定

从表5可以看出，不同厂家六味地黄丸中没食子酸含量不同，超声辅助萃取3个厂家药品中的没食子酸含量为0.938 4～1.082 7 mg/g，与浸渍提取法相比，超声辅助萃取法提取的没食子酸含量高出17.14%～23.62%。

3 结论

采用超声辅助萃取法提取六味地黄丸中的没食子酸，通

过单因素试验，分别研究溶剂比例（甲醇∶0.1%乙酸）、超声温度、

超声时间和超声功率对没食子酸提取量的影响，根据单因素试验结果设计L9（34）的正交试验。分析正交试验数据，确定影响没食子酸提取量的因素顺序为溶剂比例>超声温度>超声时间>超声功率，最优组合为A1B2C3D3，即溶剂比例（甲醇∶0.1%乙酸）2∶8、超声温度40 ℃、超声时间30 min、超声功率180 W。超声辅助萃取法与浸渍提取法相比，六味地黄丸中没食子酸提取量增加了17.14%～23.62%。

参考文献

[1]

陈玉武，薜智.制萸肉免疫活性成分的化学研究[J].中日友好医院学报，1992，6（S1）：231-234.

[2] SANAE F，MIYAICHI Y，HAYASHI H.Endothelium dependent contraction of rat thoracic aorta induced by gallic acid[J].Phytother Res，2003，17（2）：187-189.

[3] 鄧秀霞，李琴，王留留.山茱萸果核中没食子酸的提取及检测方法[J].农业机械，2011（32）：137-140.

[4] 刘丽艳.分心木中没食子酸的提取工艺研究[J].广东化工，2018，45（2）：42-43.

[5] 柯发敏，侯杰荣，余昕，等.赶黄草中没食子酸的提取方法比较研究[J].食品研究与开发，2016，37（7）：75-77.

[6] 吴春燕.芒果叶中没食子酸的提取研究[J].化工技术与开发，2012，41（10）：20-22.

[7] 刘忠英，高展，罗赛，等.普洱茶没食子酸的提取分离工艺研究[J].西南师范大学学报（自然科学版），2015，40（4）：47-52.

[8] 陈方平，金淳，魏加球.倍花酸水解法制工业没食子酸[J].林产化学与工业，1989，9（1）：34-41.

[9] 陈茜文，谷文众，王贵武.倍花浸提液水解制备没食子酸的工艺[J].中南林业科技大学学报，2008，28（5）：132-135.

[10] 王蔚文，李务强.没食子酸发酵新工艺（简报）[J].林化科技通讯，1986（3）：15-17.

[11] 杨顺楷，杨亚力.酶法转化五倍子单宁酸生产没食子酸[J].精细与专用化学品，2005，13（5）：12-13，15.