火炭母提取物抑菌性能研究

宋姗姗 杨艾华 王微微 王俣棋 范红结 王小敏

摘要 为解决细菌在不同食品表面以及食品工业环境中形成生物膜引起食品质量安全问题，以中药材火炭母提取物为对象，对不同供试菌株进行抑制细菌及抑制细菌生物膜试验，探讨其抑菌性能。结果表明：火炭母提取物对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的生长均有一定的抑制作用，其最低抑菌浓度（MIC）分别为3.91、1.95、15.63、15.63 mg/mL;在亚抑菌浓度下，火炭母提取物能有效抑制金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜形成，其最小生物膜清除浓度（MBEC）分别为0.98和0.49 mg/mL。

关键词 火炭母;提取物;抑菌;细菌;生物膜

中图分类号 R-285  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）12-0187-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.048

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Antimicrobial Properties of the Extracts from Polygonum chinense L.

SONG Shan shan，YANG Ai hua，WANG Wei wei et al （School of Basic Medicine Sciences，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563000）

Abstract In order to solve the problem of food quality and safety caused by bacteria forming biofilm on different food surfaces and in food industry environment，this study took the extract of Polygonum chinense as the object，carried out bacteriostatic and bacteriostatic membrane tests on different index strains，and discussed its bacteriostatic performance.The results showed that the extract of Polygonum chinense had a certain inhibitory effect on the growth of Staphylococcus aureus，Staphylococcus epidermidis，Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa，and the minimum inhibitory concentrations （MIC） was 3.91，1.95，15.63 and 15.63 mg/mL，respectively.Under the concentration of subbacteriostatic bacteria，the extract of Polygonum chinense could effectively inhibit the biofilm formation of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis， the minimum biofilm removal concentration （MBEC） was 0.98 and 0.49 mg/mL，respectively.

Key words Polygonum chinense L.;Extract;Antibacterial;Bacteria;Biofilm

目前，國内对生物膜的研究在医学及环境学方面比较广泛，在食品方面重视程度较低。然而，其引起的食品安全问题却不容忽视。细菌生物膜广泛存在于各种食品和食品加工表面，可引起食源性疾病暴发和加速食品腐败，严重制约了食品工业的健康发展[1]。研究表明，细菌生物膜是其在生长过程中，为了适应生存环境由细菌自身分泌的多糖、DNA、蛋白质等胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS）组成的一个具有三维立体空间结构的生态系[2]。在生物膜的保护下，细菌耐受性增强，显著增加食品安全风险[3]。

已有研究表明，植物源天然减菌剂能够通过破坏细胞壁或细胞膜、抑制蛋白质功能或与遗传物质结合、抑制细菌和真菌[4]。

火炭母（Polygonum chinense L.）为蓼科植物，是民间常用道地药材，也是“广东凉茶”“王老吉”和“二十四味”等凉茶的主要组成成分之一，具有清热利湿、凉血解毒的功效，可用于湿热泄泻、痢疾、黄疸、咽喉肿痛等病症的治疗[5-6]。近年来对火炭母的研究主要集中于化学成分和药理作用，已有研究发现，火炭母具有抗氧化及清除自由基、抗炎、镇痛、抗腹泻、抗肝癌等作用[7]，而针对本品作为抗菌抗生物膜减菌剂方面的研究则鲜有报道。因此，该研究以中药材火炭母为对象，采用65%乙醇溶液为提取液，通过超声波辅助手段提取火炭母有效成分，且经低温冷冻干燥处理，去除有机溶剂的影响;分析不同浓度火炭母提取物对各供试菌株的最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）、最小生物膜清除浓度（MBEC）及生长周期的影响，探讨火炭母提取物的抑菌性能，为其综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 火炭母购买自遵义经方药堂，取全株40 ℃烘干粉碎，过100目筛制成火炭母粉末备用;金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CMCC26003）、大肠杆菌（Escherichia coli CMCC44102）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa CMCC10104）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis CMCC26069），均由遵义医科大学微生物与免疫学实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 火炭母提取物的制备。称取5 g火炭母干燥粉末，以65%乙醇为溶剂，超声波振荡30 min、45 ℃水浴30 min后低速离心取上清液，沉淀按照上述步骤重复提取2～3次。收集上清液至旋转蒸发仪减压浓缩，所得浓缩物低温冷冻干燥成粉末，将粉末用无菌水配制成浓度1.0 g/mL的火炭母提取物母液，121 ℃灭菌15 min，保存备用。

1.2.2 供试菌液的制备。挑取各供试菌单菌落，接种于50 mL LB培养基中，37 ℃ 180 r/min振荡培养15～18 h，使细菌达到对数生长期，无菌生理盐水调整细菌浓度至1.5×108 CFU/mL，备用。

1.2.3 火炭母提取物抑菌活性的测定。将各供试菌菌液均匀涂布于营养琼脂培养基表面，待表面干燥后，等距离放置无菌牛津杯，轻轻按压后加入药液。试验组：1.0 g/mL火炭母提取物50 μL，对照组：0.9%无菌生理盐水50 μL，每组设置3个重复。37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径大小。

1.2.4 火炭母提取物最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定。取各供试菌菌液50 μL，加至含不同浓度火炭母提取物的LB培养基中，37 ℃ 180 r/min振荡培养24 h，观察结果。取试管内液体50 μL均匀涂布于营养琼脂平板表面，37 ℃培养24 h，平板菌落计数。

1.2.5 火炭母提取物对各供试菌株生长的影响。将各供试菌菌液加至含有不同浓度火炭母提取物的LB培养基中，37 ℃ 180 r/min振荡培养，每隔2 h取样测定OD600值，每个火炭母提取物浓度做3个重复，取平均值，以OD600值为纵坐标、生长时间为横坐标，绘制生长曲线。

1.2.6 生物膜形成能力的检测。将各供试菌接种于刚果红平板上，37 ℃培养24 h，室温放置24 h，观察结果。

1.2.7 火炭母提取物对生物膜形成的影响。LB培养基稀释火炭母提取物母液，配制不同浓度的药液。96孔板上每孔加入100 μL供试菌液和不同浓度的火炭母提取物药液100 μL，每组设置3个重复孔，空白对照组加入200 μL LB培养基。37 ℃培养24 h，结晶紫半定量染色法处理，570 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 火炭母提取物对各供试菌株的抑制作用 试验结果显示，1.0 g/mL火炭母提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直径分别为18.3±0.1、8.3±0.2、11.3±0.1、24.0±0.1 mm，表明火炭母提取物对4种供试菌均有不同程度的抑制作用。根据药理学试验方法（抑菌圈直径≥16 mm为高度敏感，11～15 mm为中度敏感，≤10 mm为轻度敏感）[8]分析，表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌对火炭母提取物为高度敏感，铜绿假单胞菌为中度敏感，大肠杆菌为轻度敏感。

2.2 MIC和MBC的确定 从表1可以看出，火炭母提取物对革兰氏阴性菌（大肠杆菌和铜绿假单胞菌）的抑菌效果较弱，对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）的抑菌效果较强。其中表皮葡萄球菌的MIC和MBC均最低，说明该指示菌对火炭母提取物最敏感。

2.3 火炭母提取物对各供试菌生长曲线的影响

为进一步确定火炭母提取物在低于MIC浓度下对各供试菌生长是否产生影响，在不同药物的浓度作用下，對供试菌的生长曲线进行了测定。由图1可知，火炭母提取物在5、10和15 mg/mL时对铜绿假单胞菌均有抑制作用，但5和10 mg/mL 时，其抑制作用相似;火炭母提取物在1.0、1.5 mg/mL时对表皮葡萄球菌的生长过程和最大生长量均有一定的抑制作用，且抑制作用随药物浓度增高而增强;火炭母提取物在1.5、2.5和3.5 mg/mL时，对金黄色葡萄球菌的生长过程和最大生长量均具有显著的抑制作用，但3种药物浓度的抑制作用几乎无差异;火炭母提取物在5 mg/mL时，大肠杆菌的生长与对照组相比无生长延迟现象，但在10和15 mg/mL 时，对大肠杆菌的生长具有抑制作用。

2.4 生物膜形成能力的检测

刚果红平板检测结果显示，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的菌落为黑色、光亮的干燥菌落，判定为细菌生物被膜阳性菌株;大肠杆菌和铜绿假单胞菌的菌落为白色干燥菌落，判定为细菌生物被膜阴性菌株。

2.5 火炭母提取物对生物膜形成的影响 经结晶紫半定量染色，570 nm处测定吸光度。由表3可知，火炭母提取物对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜的形成均产生了一定的抑制作用。金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的MBEC值分别为其MIC值的1/4，即火炭母提取液对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的MBEC值分别为0.98和0.49 mg/mL。研究证实火炭母提取物对上述2种细菌生物膜形成具有明显的抑制作用，且药物作用浓度均低于其药物最低抑菌浓度，说明药物活性成分能够穿透生物膜基质，在亚抑菌浓度下促进生物膜内细菌的死亡，抑制生物膜的形成。

3 结论

不同浓度的火炭母提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌均具有一定的抑制作用，抑制效果与浓度呈正相关;表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）均最低，说明该指示菌对火炭母提取物最敏感;火炭母提取物对革兰氏阳性菌抑菌效果显著，对革兰氏阴性菌的作用较弱，尤其是大肠杆菌。究其原因可能与火炭母提取物活性成分种类和含量有关，但具体成分分析还有待进一步深入研究。在低于各供试菌株MIC浓度下，火炭母提取物对各供试菌株的生长曲线与正常生长曲线相比发生显著变化，并可有效抑制生物膜的形成。表明菌种生长刚进入对数生长期，其生长状态和生物膜形成能力就受到提取物的影响。

火炭母广泛分布于我国浙江、江西、云南、四川、贵州等南方地区，资源丰富、价格低廉、提取工艺简单，符合消费者对食品安全的追求[9-10]。因此，可深入研究火炭母对微生物的抑制作用，将其作为一种可应用于食品的清除生物膜消毒剂，更广泛地使用到食品工业中。

参考文献

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