药桑不同部位中1-脱氧野尻霉素的提取工艺优化及含量测定分析

伊丽则热?艾拜杜拉 陈冰婷 李德龙 谭惠文 马晓丽

摘要 [目的]采用高效液相色谱-荧光法测定药桑不同部位1-脱氧野尻霉素（1-DNJ）含量。[方法]用AQC为衍生试剂进行衍生化反应，流动相为乙腈-乙酸铵（85∶15），流速1.0mL/min，进样量10 μL，最大激发波长250 nm，最大发射波长为395 nm下进行荧光检测;用正交试验考察最佳提取工艺条件。[结果]通过正交试验，得到最佳提取工艺为65%乙醇、料液比1∶150、超声功率150 W、提取次数2次、超声时间10 min，在最佳提取工艺下，桑叶、果实、桑枝中1-DNJ的含量分别是1.069%、0.341%、0.078%。[结论]高效液相色谱-荧光检测法操作简便、灵敏度高、准确可靠，可用于药桑不同部位的1-DNJ含量测定。

关键词 药桑;1-脱氧野尻霉素;提取工艺;优化;含量测定;正交试验;高效液相色谱-荧光检测

中图分类号 R-284文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）11-0178-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.048

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of Extraction Technology and Determination of 1-Deoxynotahirymycin in Different Parts of Mulberry

ABAYDULA Yilzera，CHEN Bing-ting，LI De-long et al

（College of Pharmacology，Xinjiang Medical University，Urumqi，Xinjiang 830011）

Abstract [Objective]To determine the content of 1-DNJ in different parts of mulberry by high performance liquid chromatography-fluorescence method.[Method]AQC was used as the derivative reagent to conduct the derivative reaction and generate the fluorescence product.The fluorescence detection was performed by HPLC at the maximum excitation wavelength of 250 nm and the maximum emission wavelength of 395 nm.The optimal mobile phase was ammonium acetonitrile acetate （85∶15），flow rate of 1.0 mL/min，and sample injection volume of 10 μL.Orthogonal experiment was used to investigate the optimal extraction process conditions.[Result]Through orthogonal experiment，the best extraction process was 65% ethanol，solid-liquid ratio 1∶150，ultrasonic power 150 W，extraction times 2 times，ultrasonic time 10 min.Under the best extraction process，the content of 1-DNJ in mulberry leaves，fruits，and mulberry branches was 1.069.%，0.341%，0.078%，respectively.[Conclusion]The high performance liquid chromatography-fluorescence detection method was simple，sensitive，accurate and reliable，and could be used for the determination of 1-DNJ content in different parts of mulberry.

Key words Mulberry;1-DNJ;Extraction process;Optimization;Content determination;Orthogonal test;High performance liquid chromatography-fluorescence detection

藥桑在植物分类学上属黑桑种 （Morus nigra Linn.），是自然界极为罕见的稀贵桑树半栽培半野生资源，也是我国唯一的黑桑种，栽培适应地仅限于新疆[1]。目前已从桑树植物中分离出十几种多羟基生物碱，其中主要是1-脱氧野尻霉素（l-Deoxynojirimycin，1-DNJ），其是一种天然糖的结构类似物[2]。1-DNJ是一种有效的α-糖苷酶抑制剂，具有多种药理作用（如肥胖病、糖尿病、抗病毒感染），其在体内停留时间较短，不需要肝脏代谢，无毒性积累及无代谢副产物，是目前桑资源综合开发利用的重点[3-4]。

1-DNJ为典型的哌啶型生物碱，结构中没有苯环、双键和羰基等发色团，在紫外波长范围内吸光度非常弱，无法直接用紫外检测器检测到;且结构中含有多个羟基，属氮杂糖类，分子极性较大，普通方法进行定性定量较困难。目前对桑叶、桑枝皮中的DNJ主要以乙醇溶液、酸液等为提取剂，通过常温浸泡、加热回流、超声波等进行提取[5-8]，并利用有机溶剂萃取、有机溶剂沉淀、离子交换、色谱层析和反相高效液相色谱法等方法进行分离，1-DNJ 的含量测定则常采用HPLC-MS/MS、HPLC-ELSD、HPLC-UV 或 HPLC 柱前衍生化法[9-15]。该试验为研究药桑不同部位中1-DNJ的最佳提取工艺和含量测定，以盐酸为提取剂超声提取，在提取过程中，由于不同的提取溶剂、提取料液比、提取次数、提取时间对药桑中1-DNJ提取有一定影响，因此采用正交试验[16-17]考察最佳提取工艺条件，再用HPLC柱前衍生法结合荧光检测法进行含量测定，以期为新疆药桑的药用资源开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器。高效液相色谱仪（日本岛津，LC-20AB泵，RF-20A荧光双波长检测器，色谱柱phenomenexm，4.6 mm×250 mm，5 μm，Lcsolution色谱工作站）;高功率数控超声波清洗器（KQ-500PE型，昆山市超声仪器有限公司）;pH计（雷磁PHSJ-3F）;离心机（TOL-5A，上海菲恰尔分析仪器有限公司）;分析天平（BS110S）;涡旋仪（MS3BS25）。

1.1.2 试剂。1-脱氧野尻霉素（中国药品生物制品检定所，批号：MUST-11050502）;AQC衍生试剂（Waters公司）;甲醇（Fisher公司）;乙酸铵（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）;乙腈（Fisher公司）;乙醇、氨水（优级纯，天津市光复精细化工研究所）;UPLC用水（MILLPORD）。

1.1.3 药材。药桑各药用部位购买于新疆和田当地药材市场，均由新疆医科大学中医学院徐海燕副教授鉴定。标本存放于新疆医科大学中心实验室。

1.2 方法

1.2.1 对照品贮备液的制备。精密称取1-DNJ对照品5.00 mg 于5 mL容量瓶中，加入0.05 mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀得1 mg/mL的1-DNJ储备液备用。

1.2.2 供试品溶液的制备。精密称定药桑果实、桑叶、桑枝3组样品粉末，各2份，每份1.0 g，置于具塞锥形瓶中，通过设计正交试验，在不同试验条件下对药桑不同部位的3组样品进行2次提取，将提取液经减压抽滤，合并2次滤液。水浴锅蒸发浓缩至10 mL，置于4 ℃冰箱内保存备用。

1.2.3 1-DNJ衍生化。取“1.2.2”项下样品粗提取液10 μL于2 mL的离心管中，加80 μL Buffer，涡旋30 s，使样品充分混匀于Buffer中，再加入10 μL AQC溶液，混匀后于室温反应5 min，用0.22 μm的一次性针头过滤器过滤后，取10 μL进样分析。

1.2.4 最大吸收波长的选择。取对照品溶液1 mL，在200～800 nm紫外波长内扫描，绘制吸光度-波长曲线，确定最大吸收波长。

1.2.5 色谱条件优化。取0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲盐-乙腈（85∶15，V/V）和乙腈-乙酸铵（85∶15、90∶10、95∶5）作为流动相，最大激发波长为 250 nm，最大发射波长为395 nm。流速为1.0mL/min，进样量为10 μL。

1.2.6 专属性试验。在确定的色谱条件下分析，采用三点法用PDA检测图中主峰的纯度，提取峰前、峰尖和峰尾的紫外图。取20 mg/mL药桑样品溶液各25 μL，按“1.2.5”优化色谱条件进行测定。

1.2.7 方法学考察。

1.2.7.1 线性关系考察。精密吸取“1.2.1”项下对照品贮备液适量，分别置于10mL容量瓶中，加0.05 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，得到0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、25.0、50.0 μg/mL的对照品溶液。精密吸取上述8种溶液各10 μL，衍生后，按“1.2.5”优化色谱条件分别进样测定。以对照品浓度X（μg/mL）为横坐标、峰面积Y为纵坐标进行线性回归，得回归方程。

1.2.7.2 精密度试验。取同一供试品溶液，在“1.2.5”色谱条件下连续进样5次，测定吸光度的RSD值。

1.2.7.3 重复性试验。取同一批样品6份，按“1.2.2”项下供试品溶液的制备法制备，并在“1.2.5”色谱条件下进样测定吸光度的RSD值。

1.2.7.4 稳定性试验。取料液比1∶150、超声功率150 W、 提取次数2次、超声时间10 min提取条件下的供试品溶液，在0、2、4、 8、12、24、48 h按“1.2.5”色谱条件分别进样测定。

1.2.7.5 加样回收率试验。精密称取已知含量的药桑样品粉末约0.1 g，共9份，分为3组，按低、中、高浓度分别加入1-DNJ对照品0.12、0.15、0.18 mg ，按“1.2.2”方法制備供试品溶液，按“1.2.5”色谱条件进样测定，计算加样回收率。

1.3 1-DNJ样品提取的正交试验

1.3.1 正交试验设计。选择影响1-DNJ提取效果各因素中有意义的水平做正交试验，对结果进行极差分析，以确定最佳提取条件。选取以料液比（A）、超声时间（B）、超声功率（C）、提取次数（D）4个因素，每个因素选用3个水平，用L9（34）正交表进行试验。因素水平见表1。

1.3.2 验证试验。按上述最佳提取工艺条件进行3次验证试验，获得最佳试验方案，在最佳试验方案条件下提取药桑不同部位中1-DNJ含量。

1.4 最佳提取工艺条件下样品含量测定 分别取不同样品（果实、桑叶、桑枝，每个样品取3份），按“1.3”项下最佳提取工艺条件，同“1.2.2”方法制备供试品溶液操作，并按“1.2.5”色谱条件进行测定。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长 在200～800 nm紫外波长内扫描，从吸光度-波长曲线（图1）可以看出，250 nm波长处有最大吸收波长。

2.2 色谱条件优化 最终筛选的最佳色谱条件为乙腈-乙酸铵（90∶10）作为流动相，最大激发波长为 250 nm，最大发射波长为 395 nm。流速为1.0mL/min，进样量为10 μL。图谱结果显示（图2），标准品和样品在13 min时出峰，分离效果好。

2.3 专属性试验 采用三点法用PDA检测药桑样品图中主峰的纯度，提取峰前（半峰高处）、峰尖和峰后（半峰高处）的紫外光谱图（图3）。图谱结果显示峰前、峰尖和峰尾提取的紫外图一致，由此可知在上述色谱条件下，1-DNJ峰形良好，与其他化学成分及杂质能有效分离（分离度大于1.5）。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察。按“1.2.7.1”操作，计算得出线性回归方程Y=52 439X+51 419（r=0.999 9）。试验结果表明，1-DNJ对照品溶液浓度在0.5～50.0μg/mL线性关系良好。

2.4.2 精密度试验。按“1.2.7.2”操作，计算出吸光度的RSD为1.51%（n=6），表明精密度试验符合要求。

2.4.3 重复性试验。按“1.2.7.3”操作，计算出吸光度的RSD为1.51%（n=6），表明该方法重复性好。

2.4.4 稳定性试验。按“1.2.7.4”操作，结果发现48 h内1-DNJ色谱峰面积无明显变化，RSD为1.70%，表明被测样品在48 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验。按“1.2.7.5”操作，药桑样品液加样回收率结果见表2，结果表明该方法准确、可靠，适用于1-DNJ成分的测定。

2.5 正交试验 由表3可知，影响1-DNJ提取率的因素主次顺序为A>C>D>B，即料液比的影响最大，其次是超声功率、提取次数，超声时间的影响最小。1-DNJ最佳提取工艺条件为A3B1C2D2，即料液比1∶150，超声时间10 min，提取次数2次，超声功率150 W。

按上述最佳提取工艺条件A3B1C2D2进行3次验证试验，由验证结果可知，按最佳工艺条件，即料液比1∶150、超声功率150 W、提取次数2次、超声时间10 min，提取得到的1-DNJ含量均高于其他各正交试验值，同时其RSD为1.46%，说明此工艺条件稳定、可行。

2.6 样品含量测定 由表4可知，药桑果实、桑叶、桑枝中1-DNJ平均含量分别为0.341%、 1.069%、0.078%。

3 讨论与结论

由于1-DNJ是一种不带发色基团的小分子含氮化合物，在紫外和可见光波段内无吸收峰，不能直接用HPLC-荧光法进行检测分析。文献中大多采用9-芴甲氧羟基（FMOC）衍生，该衍生试剂有毒，且DNJ-FMOC络合物在室温非酸性条件下不稳定，半衰期仅有3 d，因此该试验以AQC为衍化试剂，在一定的条件下1-DNJ与AQC反应可以生成DNJ-AQC络合物，该物质是一种荧光物质，可以产生荧光吸收，通过紫外光谱可知该衍生反应迅速，衍生产物稳定。该方法操作简单、灵敏度高且目标色谱峰分离效果好，峰面积与1-DNJ浓度呈极显著正相关，从精密度、稳定性、重现性、回收率的测定结果来看，该方法是稳定可靠的，灵敏度完全可以满足一般药桑、桑叶粉中1-DNJ测定的要求。因此，该方法可作为测定桑叶中1-DNJ含量的有效方法。

植物有效成分的提取分离是一个非常复杂的传递过程，影响因素众多，提取溶剂是其中之一。1-DNJ属于生物碱，能溶于水、酸、乙醇中。该试验选择65%乙醇作为提取溶剂，再根据正交试验，最终得到最佳提取工艺：称取样品粉末1.0 g，置于具塞锥形瓶，加15 mL 65%乙醇，密塞，称重，置超声波清洗仪中超声提取10 min，功率150 W，离心（5 000 r/min，离心10 min），将滤渣进行二次提取，条件同第1次，合并2次滤液，冷却至室温，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜。在此条件下分别提取药桑果实、桑叶、桑枝，在最佳色谱条件下进行含量测定。

在选定的最佳提取工艺结合HPLC-荧光检测条件下进行药桑果实、桑叶和桑枝中1-DNJ 的含量测定，结果发现，药桑果实、桑叶、桑枝中的1-DNJ含量分别为0.341%、1.069%、0.078%，表明药桑果实中1-DNJ含量最丰富，其次是桑叶，桑枝本身不易粉碎影响1-DNJ的提取。该试验设计正交试验方案，对各种提取影响因素综合考察，采用HPLC-荧光检测法进行含量测定并进行方法学试验考察该方法的可靠性，该方法操作方便、灵敏度高、专属性强，可适用于药桑不同部位中1-DNJ含量测定。

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