柔嫩艾美耳球虫田间分离株对地克珠利和盐霉素的耐药性检测

徐向东 吴文君 蔡为民 李文静 程振扬 刘丹丹 许金俊 李金贵 陶建平

摘要 采用鸡体试验法，利用相对卵囊产量（ROP）、病变记分减少率（RLS）、最适抗球虫百分数（POAA）和抗球虫指数（ACI）4项指标，测定了2株分离自如东县养殖场的柔嫩艾美耳球虫对地克珠利和盐霉素的耐药性。结果显示，2株分离株对地克珠利无耐药性或轻度耐药，对盐霉素均完全耐药。建议如东县养鸡场停用盐霉素，将地克珠利列入抗鸡球虫病药物方案中。

关键词 柔嫩艾美耳球虫;田间分离株;耐药性;检测

中图分类号 S-855.9  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）12-0080-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.021

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Drug Resistance Detection of Field Isolates of Eimeria tenella to Diclazuril and Salinomycin

XU Xiang dong1，WU Wen jun1，2，CAI Wei min1 et al （1.Jiangsu Co innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses/College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009; 2.Chahe Animal Husbandry and Veterinary Station of Rudong County，Nantong，Jiangsu 226432）

Abstract Selecting four indices of the relative oocyst production （ROP），the reduction of lesion scores（RLS），the  percent of optimum anticoccidial activity （POAA） and anticoccidial index （ACI），the body testing method was used to detect the resistance of two field isolates of Eimeria tenella collected from a farm in Rudong County to diclazuril and salinomycin.The results revealed that the two isolates showed no or mild resistance to diclazuril，and resistance to salinomycin.It was suggested that salinomycin should be withdrawan，and diclazuril could be used in the anti coccidiosis drug plan in the farm of Rudong County.

Key words Eimeria tenella;Field isolate;Drug resistance;Detection

鸡球虫病是由一种或多种艾美耳球虫寄生于鸡消化道引起的一种寄生虫病，死亡率20%～30%，严重时高达80%，病愈的雏鸡生长受阻，给养鸡业造成巨大的经济损失[1-3]。长期以来，鸡球虫病主要采用化学药物进行防治，并获得了很好的经济效益，但药物的长期使用不可避免地导致耐药虫株的产生。迄今为止，鸡球虫几乎对所有药物均出现不同程度的耐药性，且对同类或作用机理相同的药物产生一定程度的交叉耐药性[4-7]。球虫的耐药性使药物的防治效果降低甚至失效，有时即使增加药物浓度，防治效果仍然不佳，导致临床或亚临床球虫病的发生。增加用药剂量或延长用药时间可造成药物残留肉蛋，影响食品安全。江苏省如东县是农业与养殖业大县，据统计2018年全年家禽出栏2 430.72万羽，其中草三黄、青脚鸡、狼山鸡等本土品种鸡的饲养量占约50%，家禽规模养殖占99.28%以上，但饲养管理水平总体不高，再加上如东县属于北亚热带海洋性季风气候区，气候温和、雨水充沛、空气相对湿度大，这有利于鸡球虫病的流行，故鸡球虫病时有发生，给养鸡业带来很大的危害。为了解如东县养鸡场鸡球虫耐药性的发生情况，笔者对分离自2个鸡场的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）进行了耐药性检测，旨为指导生产中合理用药和正确选择抗球虫药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 黄羽肉鸡购自江苏京海禽业集团有限公司，出壳后即运回实验室，饲养在严格消毒的铁丝笼中，饲喂不含抗球虫药物的全价饲料。试验前用饱和盐水漂浮法检查，确认无球虫感染后用于试验。

1.2 试验虫株 2株柔嫰艾美耳球虫田间分离株，分离自江苏如东县2个养鸡场。球虫分离与种类鉴定过程如下：按照常规方法从鸡场分离卵囊，卵囊经孢子化培养后感染雏鸡，第8天从感染鸡盲肠黏膜中分离卵囊，并培养至孢子化卵囊;孢子化卵囊再经单卵囊接种雏鸡[8]，获得柔嫰艾美耳球虫纯种株。试验前按照常规方法扩增卵囊，孢子化后置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.3 试验药物与给药途径 12.96%盐霉素钠预混剂，购自内蒙古拜克生物有限公司，批号为201705018，按65×10-6的剂量混饲7 d。地克珠利溶液，购自济鲁动物保健品有限公司，批号为1704003，按1×10-6的剂量飲水7 d。

1.4 试验分组 25日龄黄羽肉鸡逐只称重、编号，选择体重相近的雏鸡110羽，分成11个组，每组10只鸡。每个虫株设置5个组，即4个药物试验组（每种药物有1组重复）、1个感染不给药组（阳性对照组）、 1个不感染不给药组（2个虫株的共同阴性对照组）。除了阴性对照组外，其余各试验组每只鸡经嗉囊接种8×104个孢子化卵囊。

1.5 临床观察与卵囊计数 感染后每天观察鸡的精神状态、饮食、饮水和粪便情况，记录血便排出情况，并参照Morehouse等[9]的标准进行血便记分。在试验过程中死亡的鸡，要及时剖检，以确定是否死于鸡球虫病。感染后第8天，将全部试验鸡称重并剖杀，取盲肠观察肠道病变，参照Johnson等[10]的方法进行肠道病变记分。从第5天起，每天收集各组鸡排出的全部粪便，采用麦克马斯特氏法计数卵囊。第8天取盲肠内容物与肠黏膜，用胃蛋白酶消化后收集卵囊，用麦克马斯特氏法计数卵囊。将盲肠中卵囊数与该试验组第5～8天粪中卵囊数相加，即得到卵囊总产量，然后求出每组每只鸡平均卵囊数。

1.6 耐药性判定方法与标准 参照黄兵等[11]的方法，以最适抗球虫百分数（percent of optimum anticoccidial activity，POAA）、相对卵囊产量（relative oocyst production，ROP）、病变记分减少率（reduction of lesion scores，RLS）和抗球虫指数（anticoccidial index，ACI）4项指标综合判定不同虫株对药物的耐药程度。POAA>50 %为阴性，POAA≤50%为阳性;ROP≥15%为阳性，ROP<15%为阴性;RLS≥50%为阴性，RLS<50%为阳性;ACI≥160为阴性，ACI<160为阳性。4项指标全部为阴性则判定为无耐药性，1项指标为阳性则判定为轻度耐药，2项指标为阳性则判定为中度耐药，3～4项指标为阳性则判定为完全耐药。各项指标计算公式如下：

POAA=（感染给药组GSR-感染不给药组GSR）÷（不感染不给药组GSR-感染不给药组GSR）×100%（1）

GSR=笼末重÷笼初重（2）

ROP=感染給药组平均卵囊产量÷感染不给药组×100%（3）

RLS=（感染不给药组平均病变记分-感染给药组平均病变记分）÷感染不给药组平均病变记分×100%（4）

ACI=（存活率+相对增重率）-（病变值+卵囊值）[12]（5）

式中，存活率=（存活鸡数÷开始鸡数）×100%;相对增重率=（用药组或感染不给药组鸡的平均增重÷不感染不给药组鸡的平均增重）×100%。病变值=每组的平均盲肠病变记分×10。卵囊值按角田清[13]的方法计算，即当ROP为0～1%时，卵囊值为0;当ROP为1%～25%时，卵囊值为5;当ROP为26%～50%时，卵囊值为10;当ROP为51%～75%时，卵囊值为20;当ROP为76%～100%时，卵囊值为40。

1.7 数据统计与分析 使用SPSS 23.0软件对试验数据进行描述性统计分析，并用邓肯氏新复极差法对组间平均值进行多重比较 （P<0.05） 。

2 结果与分析

2.1 临床观察与成活率

地克珠利给药组排出血便数最少，血便记分为0（分离株1）、0.3和1.0分（分离株2），鸡未发生死亡。盐霉素给药组排血便数较多，血便记分为3.3、3.6分（分离株1）、4.0分（分离株2），分离株1有1组死亡鸡1只，分离株2分别死亡1只和2只。感染不给药组排血便数最多，血便记分均为4.0分，分离株2死亡3只鸡。在整个试验期间，不感染不给药组鸡均正常，试验结束时粪检未见卵囊。

2.2 平均增重与最适抗球虫百分数 各组的平均增重与最适抗球虫百分数见表1。由表1可知，各地克珠利组的平均增重与不感染不给药对照组相比差异不显著（P>0.05），各盐霉素组的平均增重与不感染不给药对照组相比差异显著（P<0.05），与感染不给药组相比差异不显著（P>0.05）。各地克珠利组的最适抗球虫百分数均大于50%，各盐霉素组的最适抗球虫百分数均小于50%。

2.3 病变记分减少率与相对卵囊产量

各组平均病变记分与病变记分减少率见表2。由表2可知，各地克珠利组的平均病变记分显著低于感染不给药对照组（P<0.05），各盐霉素组的平均病变记分与感染不给药对照组差异不显著（P>0.05）。各地克珠利组的病变记分减少率均大于50%，各盐霉素组的病变记分减少率均小于50%。各盐霉素组相对卵囊产量均在60%以上，均达耐药指标。各地克珠利组的相对卵囊产量，除了虫株2有一个组为17.5%，其余均小于15%，均为药物敏感。

2.4 抗球虫指数

各试验组的抗球虫指数见表3。由表3可知，分离株1地克珠利组抗球虫指数均大于180，属于抗球虫高效水平;分离株2的地克珠利组抗球虫指数均大于170，属于抗球虫中效水平。分离株1的盐霉素组抗球虫指数均大于120，但小于160，属于抗球虫低效水平;分离株2的盐霉素组抗球虫指数均小于120，属于抗球虫无效水平。

2.5 耐药性判定结果

2株柔嫩艾美耳球虫田间分离株对地克珠利和盐霉素的耐药性见表4。从POP、RLS、POAA、ACI这4个指标进行综合评价，2株分离株对盐霉素均完全耐药，而分离株1对地克珠利无耐药性，分离株2对地克珠利无耐药性或轻度耐药。

3 讨论

目前报道的鸡球虫耐药性检测方法有鸡体实验法、细胞和鸡胚培养法、超微结构比较法、同工酶分析测定法、聚丙烯酰胺电泳技术、RAPD测定法和PCR 技术等[14]。在现场或鸡场检测鸡球虫的耐药性一般用鸡体实验法，即将试验药物按规定剂量混饲或饮水饲喂一定日龄的雏鸡，当天或一定时间后接种从现场分离的球虫，最后通过某些指标，比如粪便记分、饲料转化率、死亡率、卵囊产量或相对卵囊产量（ROP）、病变记分或病变记分减少率（RLS）、增重或最适抗球虫活性百分率（POAA）、抗球虫指数（ACI）等判定球虫的耐药性，或者以POAA、ROP、RLS 3个指标或POAA、ROP、RLS、ACI 4个指标进行综合评定[6，11，15-16]。陈兆国等[16]对POAA、ROP、RLS和ACI 4项球虫抗药性判定指标的准确性进行了评价，发现ACI准确性最好，ROP和RLS准确性较低，POAA准确性又高于RLS和ROP，认为采用4项指标进行综合判断比较科学。该研究采用POAA、ROP、RLS和ACI 4项指标进行综合判断。

自从20世纪40年代发现磺胺能治疗鸡球虫病以来，药物防治成为鸡球虫病的主要防控措施[17]。目前在临床上使用的抗球虫药有数十种，主要包括化学合成类和离子载体抗生素类[18]。地克珠利是在1986年由比利杨森制药厂研制的一种化学合成类抗球虫药，对柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型等艾美球虫均有效。地克珠利对球虫的作用峰期随球虫的不同而异，对柔嫩艾美耳球虫的无性生殖和有性生殖期都有作用，能抑制第一代和第二代裂殖生殖，抑制大、小配子间的受精作用，还能抑制卵囊壁的形成。地克珠利在我国于20世纪末就已成功合成，并在全国推广使用[19]。地克珠利的耐药性在1994年就出现了相关报道[20]。盐霉素是在1968年由日本研究制药株式会社东京研究所从白色链球菌的培养物中提取的产物，是第三个上市的离子载体类抗球虫药，对尚未进入肠上皮细胞的球虫子孢子有高度杀灭作用，对裂殖体有较强的抑制作用，对柔嫩艾美耳球虫等多种球虫有效。盐霉素的作用机制是促使离子和水过多进入球虫虫体而使其膨胀破裂。由于盐霉素能提高饲料利用率和促进雏鸡生长发育作用，故在国内外广泛使用[1]。盐霉素耐药性虫株1984年就出现在捷克[21]。

地克珠利与盐霉素的耐药性在我国最早报道于1994年和1996年[22-23]，现已在多个地区报道[4-5]。黄仪娟等[24]检测了四川部分地区的6株鸡球虫对11种抗球虫药的耐药性，结果显示有2株球虫对地克珠利完全耐药;刘颖等[25]对柳州市分离于鸡场的鸡球虫进行耐药性检测，结果发现对地克珠利完全耐药，对盐霉素轻度耐药;李星星等[26]比较了地克珠利、盐霉素、莫能菌素、尼卡巴嗪和海南霉素钠对柔嫩艾美耳球虫田间分离株的疗效，结果显示地克珠利和鹽霉素的ACI分别为159.8和159.6，均小于160。笔者测定了地克珠利和盐霉素对如东县柔嫩艾美耳球虫田间分离株的耐药性，结果显示2株田间分离株对地克珠利无耐药性或轻度耐药，而对盐霉素有完全耐药。究其原因，可能是盐霉素在该县曾经或现在已有广泛使用，而地克珠利在该市使用较少或停用时间较长。鉴于这一检测结果，建议该地区停用盐霉素，使用地克珠利，同时必须定期进行抗药性的监测。在使用抗球虫药物时应进行轮换用药或联合用药，以延长药物的使用寿命，同时还必须做好饲养管理等综合性防治措施。

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