自体培养组织工程表皮移植治疗稳定期白癜风初步临床研究

谷晓广 刁云珍 刘永生 续言凤 高丹旭

[摘要]目的：探討自体培养组织工程表皮移植治疗稳定期白癜风的临床疗效。方法：收集皮肤科10～48岁稳定期白癜风患者42例，切取患者正常皮肤（约2cm×3cm），通过酶解、消化并培养形成自体培养组织工程表皮。然后将培养的组织工程皮肤移植到患者白斑处，并进行缝合固定、加压包扎。1周后缝合处拆线、2周后拆除油纱。术后对患者进行随访，并用临床照片、辅以Wood灯分析色素恢复情况，记录复色情况，评价治疗效果。结果：2014年10月-2019年4月通过自体培养组织工程表皮移植治疗稳定期白癜风患者42例，随访12个月，结果显示自体培养组织工程表皮移植治疗稳定期白癜风整体有效率为83.3%，其中头面部有效率最高为94.7%，其次为躯干部皮损为90.9%、四肢的有效率最低为76.2%。头面部治疗有效率明显高于四肢，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：自体培养组织工程表皮移植治疗稳定期白癜风效果明显，疗效确切，安全性高。

[关键词]白癜风;稳定期白癜风;黑素细胞;组织工程表皮;皮肤移植;自体移植

[中图分类号]R758.4+1    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）04-0106-04

Preliminary Clinical Study of Autologous Culture Tissue Engineering Epidermal Grafting in the Treatment of Stable Vitiligo

GU Xiao-guang1，2，DIAO Yun-zhen3，LIU Yong-sheng1，2，XU Yan-feng1，2，GAO Dan-xu1，2

（1.Department of Dermatology，  Aviation General Hospital，Beijing 100021，China;2.Beijing Translational Medicine Research Institute of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100021，China;3.Beijing Airmet Biotechnology Co.，Ltd.Beijing 100094，China）

Abstract： Objective  To investigate the clinical efficacy of autologous culture tissue engineering epidermal grafting in the treatment of stable vitiligo. Methods  A total of 42 patients with stable vitiligo of 10-48 years old were enrolled in the dermatology department. Cutted the patients normal skin （approximately 2cm×3cm）， and form autologous culture tissue engineering epidermis through enzymolysis， digestion and culture. Then the cultured tissue engineered skin is transplanted to the patient's leukoplakia， sutured， fixed， and pressure bandaged. after 1 week， the stitches were removed from the suture， and the oil gauze was removed after 2 weeks. After the operation， the patients were followed up， and the clinical photos were used to analyze the recovery of the pigment with the aid of the Wood lamp， and the recolor situation was recorded to evaluate the treatment effect. Results  From October 2014 to April 2019， our department treated 42 patients with stable vitiligo through autologous culture tissue engineering epidermal grafting， and followed up for 12 months. The results showed that the overall effective rate of vitiligo in the stable period of autologous cultured tissue engineering was 83.3%， with the highest head and face efficiency of 94.7%， followed by the trunk lesions of 90.9% and the limbs with the lowest efficiency of 76.2%. The effective rate of head and face was significantly higher than that of limbs， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion  Autologous cultured tissue engineering epidermal transplantation has obvious effects in the treatment of stable vitiligo， with definite curative effect and high safety.

Key words： vitiligo; stable vitiligo; melanocytes; tissue engineering epidermis; skin grafting; autotransplantation

白癜风是一种常见的后天性色素脱失性皮肤黏膜疾病，临床表现为身体局部出现白斑，随着病情进展白斑面积逐渐扩大，部分患者可逐渐进展为全身弥漫白斑[1]。白癜风的发病机制目前不十分清楚，治疗比较困难，虽然治疗方法多样，但有时疗效不尽人意。而利用自体培养组织工程表皮治疗稳定期白癜风，可以为患者表皮移植提供供体，成为白斑面积较大的白癜风患者治疗的新选择。从2014年开始，笔者科室开展自体培养组织工程表皮移植治疗稳定期白癜风的研究，取得了非常满意的临床效果，现将结果报道如下。

1  资料和方法

1.1 临床资料：收集2014年10月-2019年4月稳定期白癜风患者42例为研究对象，男16例，女26例，年龄10～48岁（24.3±11.2）岁，平均病程12年，病期参照VIDA评分标准，均为稳定期白癜风患者，稳定期时间1～10年，平均稳定期5年，其中节段型24例，寻常型[1]（原非节段型）13例，未定类型（原局限型）5例。

1.2 自体培养组织工程表皮的制备：患者正常皮肤处浸润麻醉，手术切取患者该处正常皮肤（大约2cm×3cm），无菌条件下送GMP洁净实验室。本文组织工程表皮制备利用改良的Green方法由北京艾美特夫生物科技有限公司提供，具体培养步骤如下：取下的全层皮肤首先进行进一步消毒后，用胰酶蛋白酶等消化，获得表皮组织悬液后，计数，计算活细胞率。活细胞率通常在90%以上。将这些细胞用配制的表皮细胞专用培养基混匀后，均匀地播种在培养皿中，静置在二氧化碳培养箱中。培养后第1天观察表皮细胞的贴附着和克隆生长状态。培养过程中每2～3d更换新的培养基。临床患者的需求一般在50～200cm2的培养表皮，培养天数通常为14～21d。2～3周后，表皮细胞增殖到一定数量，细胞之间形成连接，并分化增厚成2～5层的层状表皮。培养表皮中均匀分布着黑素细胞（黑素细胞与表皮细胞百分比约为7%～18%）。在患者指定的手术日，用水解酶将培养表皮细胞层从培养皿上取下，清洗后转移到运输容器中，无菌条件下运抵手术室待用。

1.3 自体培养组织工程表皮的移植：移植当天，将培养成形的表皮从培养皿中剥离，用磷酸缓冲溶液洗净以备移植用;患者皮损处用1%利多卡因、罗哌卡因、1%肾上腺素混合局部麻醉后，用电动皮肤磨削机对患处皮肤表层磨削。将培养表皮的基底膜面着磨削区域覆盖;将涂有抗菌软膏的油纱布（非粘贴性纱布）覆盖于移植部位后进行固定缝合;用纱布固定，以防止手术部位被拉动。移植1周后，拆线、替换保护用固定纱布;移植2周后，移除非粘贴性纱布，避免阳光曝晒。移植后的第1、3、6、12个月随访观察，数码相机拍照记录，部分患者辅以Wood灯分析色素恢复状况，记录复色情况及不良反应。

1.4 疗效评价：治疗前后及治疗过程中拍照记录，采用AdobePhotoshop 7.0图像软件系统测复色面积。疗效标准：痊愈为色素恢复100%;临床痊愈为色素恢复>90%（临床近距离表现为轻度鹅卵石样外观或个别地方未复色，整体复色>90%）;显效为色素恢复60%～89%;好转为色素恢复25%～60%;无效为复色面积<25%皮损面积。有效率=痊愈率+显效率。痊愈率=（痊愈+临床痊愈）例数/总例数×100%。

1.5 统计学分析：使用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，各组间差异比较采用χ2检验。

2  结果

移植1～2个月时局部显示粉红色，Wood灯显示色素附着;移植6个月时局部色素逐渐恢复正常，部分患者1年时仍可见色素恢复。所有病例随访最少6～12个月，最长随访40个月，未发现瘢痕及产生的色素出现色素脱失现象;小部分患者配合局部外用他克莫司软膏或辅以低能量311nm窄谱中波紫外线或308nm準分子光治疗，个别患者治疗部位显示有辅助色素恢复作用。

42例不同临床分型患者疗效：24例节段型患者中痊愈率为41.7%（10/24），有效率为75.0%（18/24）。13例寻常型（原非节段型）患者中痊愈率为69.2%（9/13），有效率为92.3%（12/13）。5例未定类型（原局限型）患者中痊愈率为60.0%（3/5），有效率为100.0%（5/5）。通过上结果显示该技术对不同类型患者的治疗有效率均达到75%以上，整体有效率为83.3%，显示了非常好的疗效，见表1。

62处不同部位皮损治疗效果：42例患者共62块皮损，其中痊愈、临床痊愈28处（45.2%），显效26处（41.9%），好转7处（11.3%），无效1处（1.6%），有效率为87.1%。其中头面部有效率最高为94.7%，其次为躯干部皮损为90.9%、四肢的有效率最低为76.2%，头面部治疗有效率与四肢治疗有效率比较差异有统计学意义（P<0.05）

3  讨论

白癜风是一种后天性的局限性或泛发性的皮肤色素脱失性皮肤病。临床表现为身体局部出现白斑，随着病情进展白斑面积逐渐扩大，部分患者可逐渐进展为全身弥漫白斑。是一种慢性并且极其影响患者容貌的皮肤病[2]。白癜风的病因尚不清楚，近年研究显示：①组织学及免疫细胞学显示白癜风表皮黑素细胞消失，活动性白斑边缘的真皮内有淋巴细胞浸润;②患者血清中存在抗黑素细胞抗体，且滴度与病变的程度成正比;③将正常人皮肤移植到裸鼠，注射白癜风患者IgG可使移植的皮肤出现白斑;④内服或外用皮质类固醇或其他免疫抑制剂能取得明显疗效[3]。这些发现表明白癜风是一种与自身免疫密切相关的疾病。目前白癜风的治疗方法很多，可以用系统治疗如口服激素、局部治疗可以外用糖皮质激素乳膏、盐酸氮芥、局部或系统光化学疗法、紫外线治疗、外科手术自体皮肤移植等，但以上所有方法疗效比较局限，部分患者对上述所有方法无效、导致白斑面积不断发展[4]。

表皮细胞的成功培养触发了组织工程皮肤研究的开端。1975年Rheinwald和Green采用3T3细胞作为滋养层，在体外成功连续培养人表皮角质形成细胞[5]。1981年0Connor等首次將此种方法培养的自体表皮膜片（cultured epithelial autograft，CEA）用于烧伤创面的修复，获得成功[6]。上述的研究表明烧伤后的色素减退可以通过皮肤移植而使该部位成功复色，进一步证明了色素脱失性疾病可以通过组织工程表皮的移植而获得复色的可能性。1997年，Kumagai和Uchikoshi[7]的研究显示：通过Green方法而培养成功的自体表皮膜片，治疗了6例包含白癜风、斑驳病和白化病等的色素减退患者，全部获得成功。自体培养组织工程表皮是从患者自身的皮肤组织分离出来的表皮细胞在体外培养扩增，形成一到多层的膜片样的组织，组织结构近似于人的正常表皮组织[8]。该组织工程表皮的表皮细胞和黑素细胞均来源于患者自身正常皮肤[9]。然后通过对白癜风患者白斑区域的皮肤磨削以及自体皮肤移植，把培养的组织工程表皮移植到患者白斑区域，加压包扎，数周后该白斑区域达到很好的复色[10]。自体皮肤移植分为三类：含黑素细胞的正常皮肤（表皮或表皮和真皮）移植;非培养的含有黑素细胞的表皮或者毛囊移植;生长于附着物的培养的黑素细胞（含有或者不含有角质形成细胞）移植[11-12]。有学者对自体培养黑素细胞治疗白癜风进行了深入研究，取得了较好的临床效果。近年来我国学者已将组织工程皮肤培养[13-14]、自体黑素细胞培养、自体移植技术[15-16]应用于临床，并取得了很好的临床效果。本研究通过自体培养组织工程表皮移植技术对募集的42例稳定期白癜风患者进行治疗，治疗后通过临床照片、辅以Wood灯分析色素恢复情况，对患者疗效进行统计分析，显示总的有效率达到83.3%，各个部位的有效率也进行了相关统计，其中头面部有效率最高达到了94.7%，其次为躯干部皮损为90.9%、四肢的有效率最低但是也达到了76.2%，该治疗方法有效率明显优于传统治疗方法，该治疗方法对白癜风各个部位复色的难易度与传统方法相同，表明肢端白癜风患者治疗是非常困难的，但是与传统方法想比该方法有效率仍达到76.2%，也显示了其相对于传统治疗方法的优越性。

研究显示，自体培养组织工程表皮移植治疗白癜风效果明显，治疗面积大，复色均匀，值得临床推广应用。这种方法对于那些药物治疗无效的稳定期白癜风患者而言，是一种很好的选择。

[参考文献]

[1]中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组. 白癜风诊疗共识（2018版）[J].中华皮肤科杂志，2018，51（4）：247-250.

[2]Frisoli ML，Essien K，Harris JE.Vitiligo： mechanisms of pathogenesis and treatment[J].Annu Rev Immunol，2020，38（1）：621-648.

[3]Konstantinova VA，Olisova OY，Gladko VV，et al.Vitiligo-new treatment approach[J].Clin Cosmet Investig Dermatol，2019，12（18）：911-917.

[4]王旭超，李剑，林尽染.白癜风的外科治疗进展[J].中国美容医学，2019，28（11）：171-173.

[5]Rheinwald JG，Green H.Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma[J].Cell，1975，6（3）：317-330.

[6]O'Connor N，Mulliken J，Banks-Schlegel S，et al.Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal cells[J].Lancet，1981，317（8211）：75-78.

[7]Kumagai N，Uchikoshi T.Treatment of extensive hypomelanosis with autologous cultured epithelium[J].Ann Plast Surg，1997，39（1）：68.

[8]张彦刚，胡大海，张战凤，等.人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建[J].中国美容医学，2011，20（1）：79-82.

[9]Zhou H，You C，Wang X，et al.The progress and challenges for dermal regeneration in tissue engineering[J].J Biomed Mater Res A，2017，105（4）：1208-1218.

[10]Matsuzaki K，Kumagai N.Treatment of vitiligo with autologous cultured keratinocytes in 27 cases[J].Eur J Plast Surg，2013，36（10）：651-656.

[11]Komal V，Atul C，Shweta T，et al.Advances in skin regeneration using tissue engineering[J].Int J Mol Sci，2017，18（4）：789.

[12]Bhardwaj N，Chouhan D，Mandal BB.Tissue engineered skin and wound healing： current strategies and future directions[J].Curr Pharm Des，2017，23（24）：3455-3482.

[13]朱美财，王雅静，占志，等.自体黑素细胞体外培养移植治疗白癜风[J].中华皮肤科杂志，2007，40（4）：210-212.

[14]张迪敏，洪为松，傅丽芳，等.个体化培养自体黑素细胞移植治疗白癜风[J].中华皮肤科杂志，2010，43（10）：721-725.

[15]徐伟爱，吴辛刚，洪为松，等.自体培养黑素细胞移植联合窄谱中波紫外线治疗白癜风疗效观察[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2011，10（3）：162-164.

[16]李剑，吴文育，陈淑君，等.带黑素细胞的组织工程化表皮膜片移植治疗白癜风的初步临床研究[J].中华皮肤科杂志，2015，48（3）：162-165.

[收稿日期]2020-05-14

本文引用格式：谷晓广，刁云珍，刘永生，等.自体培养组织工程表皮移植治疗稳定期白癜风初步临床研究[J].中国美容医学，2021，30（4）：106-109.