水母雪莲多糖对UVB诱导的小鼠皮肤损伤保护作用的机制研究

曾智 孔悦 郭砚

[摘要]目的：探讨水母雪莲（Saussurea Medusa Maxim）多糖对中波紫外线（Ultraviolet B，UVB）诱导的小鼠皮肤损伤保护作用的机制研究，奠定其临床应用理论基础。方法：30只昆明种雄性小鼠随机分为正常组、UVB组、UVB+水母雪莲组三组。UVB组和UVB+水母雪莲组皮下注射5% D-半乳糖10ml/（kg·d），同时每日UVB照射，持续造模40d;正常组正常光照饲养，每日皮下注射同体积生理盐水。第11天开始，UVB+水母雪莲组每日按剂量4g/（kg·d）灌胃水母雪莲多糖，正常组、UVB组则每日灌胃等体积的生理盐水。连续用药30d后观察小鼠皮肤组织形态学变化，测定皮肤含水量，检测水通道蛋白3（AQP3）通路中表皮生长因子受体（EGFR），細胞外调节蛋白激酶（ERK），AQP3的表达。结果：光镜下可见UVB+水母雪莲组较UVB组表皮层变薄，真皮层增厚，纤维组织增多，排列紧密有序。UVB组EGFR和ERK的表达量高于正常组，AQP3表达量低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。UVB+水母雪莲组EGFR和ERK的表达量低于UVB组，AQP3表达量高于UVB组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：水母雪莲多糖能通过AQP3通路来减轻UVB导致的小鼠皮肤损伤。

[关键词]水母雪莲;皮肤光老化;水通道蛋白;胶原纤维;中波紫外线

[中图分类号]R339.3+8    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）04-0102-04

The Protective Effect of Saussurea Medusa Maxim Polysaccharide on UVB Induced Skin Injury in Mice

ZENG Zhi1，KONG Yue1，GUO Yan2

（1.Graduate School of Qinghai University，Qinghai 810000，Xining，China;2.Department of Medical Cosmetology，Affiliated Hospital of Qinghai University，Qinghai 810000，Xining，China）

Abstract： Objective  To investigate the protective effect of Saussurea medusa Maxim polysaccharide on UVB induced skin injury in mice， and to lay the theoretical foundation for its clinical application. Methods  Thirty Kunming male mice were randomly divided into three groups， the normal group， the UVB group and the UVB+ Saussurea medusa group. Mice in the UVB group and the UVB+Saussurea medusa group were injected with 5% D-galactose 10ml/（kg?d）subcutaneously and subjected to UVB irradiation for 40d continuously. Mice in the normal group as fed under normal light and was subcutaneously injected with normal saline of the same volume every day. Starting from the 11th day of modeling， mice in the UVB+ Saussurea medusa group was gavaged with a dose of 4g/（kg?d）， mice in the normal group and the UVB group were gavaged with normal saline of the same volume daily respectively. After 30 days， skin histomorphological variation were observed， skin moisture content was measured， and expressions of epidermal growth factor receptor （EGFR）， extracellular regulatory protein kinase （ERK）， and aquaporin 3 （AQP3） in AQP3 pathway were detected. Results  Under light microscope， compared with the UVB group， the epidermis of the UVB+Saussurea medusa group was thinner， the dermis was thicker， and the fibrous tissue was more densely arranged and orderly. The expression of EGFR and ERK in the UVB group were higher than those in the normal group， and the expression of AQP3 was lower than that in the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression of EGFR and ERK in the UVB+ Saussurea medusa group were lower than those in the UVB group， and the expression levels of AQP3 was higher than that in the UVB group （P<0.05）. Conclusion  The polysaccharide of Saussurea medusa Maxim can alleviate the skin injury of mice caused by UVB through AQP3 pathway.

Key words： Saussurea Medusa Maxim; skin photoaging; aquaporin; collagenous fiber; UVB

皮肤的光损伤主要是由中波紫外线（UVB）造成的[1-2]。UVB可使皮肤变得干燥、缺水，从而损害角质层功能，表现为皮肤粗糙、松弛、质地变硬、皱纹形成和伤口延迟愈合[3]。一旦没有及时防范与治疗，甚至发展为光化性角化病，最终导致皮肤鳞状细胞癌[4]。

水母雪莲是一种高原草本植物，为我国中藏药中的稀有珍贵药材。水母雪莲中含有丰富的黄酮、木素、多糖等成分，具有优秀的抗氧化能力，广泛应用到抗炎、抗诱变和抗癌的治疗中[5]。研究证实水母雪莲（Saussurea Medusa Maxim）多糖能够明显恢复UVB辐射后人永生化表皮细胞（Hacat）形态[6]。AQP3是人体内重要的膜通道，选择性地输送水、甘油和其他化合物[7-8]，并且AQP3在伤口愈合中也扮演很重要的角色，促进角质形成细胞迁移，增强角质形成细胞的增殖和分化[9]。但目前水母雪莲多糖通过AQP3通路对UVB诱导皮肤损伤保护作用机制相关研究尚未见文献报道。本研究将进一步在动物水平探讨水母雪莲多糖对紫外线诱导小鼠皮肤损伤的保护作用及相关分子机制。

1  材料和方法

1.1 实验动物：小鼠，雄性，30只，健康的SPF级昆明种小鼠，45d龄，体重20～25g，购于西安科奥生物科技有限公司[SXXK（陕）2015-002]。饲养于青海省高原研究中心SPF级实验室，实验期间小鼠自由摄食饮水。

1.2  实验药物：水母雪莲多糖（瑞林生物科技，西安）。

1.3  试剂：水合氯醛、D-半乳糖、强效RIPA裂解液（索莱宝，北京），聚氰基丙烯酸正丁酯（Butyleyanoacrylate， BCA）（赛默飞），HE染色试剂盒、Masson三色染色试剂盒（建成生物，南京），抗磷酸化细胞外调节蛋白激酶（Phospho-extracellular regulated kinase， P-ERK）抗体、抗细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases， ERK）抗体（Cell Signaling Technology），抗磷酸化表皮生长因子受体（Phospho-Epidermal growth factor receptor， P-EGFR）抗体，抗表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）抗体和抗水通道蛋白3（Aquaporin 3， AQP3）抗体（Abcam，美国），辣根过氧化物酶化学发光剂（Electrochemiluminescence， ECL）（默克密理博），辣根过氧化物酶标记二抗（索莱宝，北京）。

1.4 仪器：40W UVB紫外灯（德国PHILIPS，311～312nm），全波長酶标仪，UVB辐照度监视器（路昌电子企业有限公司，台湾）、电泳仪、化学发光成像仪均由青海大学附属医院中心实验室提供。

1.5  方法

1.5.1 动物分组造模：在室内环境温度（22℃～25℃），相对湿度50%～70%环境下，遵从随机分配的原则，将30只小鼠分为3组，每组10只：正常组，UVB组，UVB+水母雪莲组。小鼠适应性饲养1周后，开始给药造模，所有小鼠背部用脱毛剂脱掉皮肤表面毛发，暴露约5cm×5cm大小的皮肤，每5d脱毛一次。UVB组与UVB+水母雪莲组每日颈背部皮下注射5% D-半乳糖10ml/（kg·d）同时进行UVB照射[10]，具体方法如下：紫外线灯管（UVB）功率40W，照射前测光强度。在每次照射前，让灯管先预热15min，照射过程中每隔15min均轮换鼠盒位置，来确保每个笼子里小鼠接受的光强度一致，每次照射时间为40min，光源在小鼠正上方约40cm处，持续造模40d。正常组小鼠正常光照饲养，每日颈背部皮下注射同体积的生理盐水。造模第11天开始，UVB+水母雪莲组小鼠每天按照4g/（kg·d）的分量将水母雪莲多糖灌入胃中，正常组与UVB组小鼠则每天灌胃等量的生理盐水，连续用药30d。

1.5.2 取材：实验第42天，所有小鼠麻醉后，分离出背部的脱毛皮肤。一部分用于皮肤含水量的测定，一部分制作病理切片，用于HE染色和Masson染色;一部分皮肤-80℃保存进行后续实验。

1.5.3 干燥法测定皮肤含水量：用滤纸尽量擦干小鼠皮肤，裁剪颈背部约1cm×1cm范围左右的脱毛皮肤，将皮肤湿重准确称量，然后放入80℃烘箱中，烘干12h，待水分基本散发后，取出，精密称量皮肤干重，按照下列公式：皮肤含水百分率（%）=（湿重-干重）/湿重×100%，进行计算。

1.5.4 蛋白免疫印迹法检测EGFR、ERK、AQP3的表达：分别收集不同组的小鼠背部皮肤组织，加入刚从4℃冰箱取出的RIPA裂解液，在4℃低温的环境下，离心15min后取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用蛋白上样缓冲液配置蛋白体系后95℃煮10min，将样品加入到配好的凝胶中进行电泳。电泳结束后，立即进行转膜，再用脱脂奶粉室温下封闭，Tris缓冲盐溶液+Tween（Tris-buffered saline-Tween，TBST）洗膜3次，每次5min。加入一抗（抗ERK抗体，抗磷酸化ERK抗体，抗EGFR抗体，抗磷酸化EGFR抗体，抗AQP3抗体，抗GAPDH抗体）4℃孵育过夜后，TBST洗膜3次，每次5min，加入HRP标记的抗兔的IgG抗体孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。此后按显色试剂盒说明书操作显色。使用Image J进行条带分析。

1.5.5 免疫组化：将4μm石蜡切片经过二甲苯脱蜡，梯度无水乙醇脱水，3%过氧化氢孵育10min后，磷酸缓冲盐溶液（Phosphate buffer saline，PBS）清洗。血清封闭后，于AQP3抗体（抗体与抗体稀释液稀释体积比为1∶100）中4℃孵育过夜，抗兔IgG酶标抗体37℃孵育。辣根过氧化酶孵育后，二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）染色，苏木素复染。制片后在10倍、40倍显微镜下随机选取视野拍照。

1.6 统计学分析：采用SPSS 25.0统计软件进行实验数据的统计分析。计量资料以（x?±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 小鼠皮肤肉眼观察：在造模第10天、第20天、第30天、第40天对三组小鼠背部裸露皮肤拍照，肉眼观察结果如图1所示，可发现随着时间的推移，UVB组小鼠皮肤状态逐渐变差，UVB+水母雪莲组小鼠的皮肤状态恢复正常。在同一时间，与正常组对比，UVB组经过照射后呈现出皮肤颜色变红、松弛、明显干燥、脱屑、粗糙，并且出现皱纹。UVB+水母雪莲组较UVB组来说，皮肤完整光滑无皱纹，无红肿和色素沉着，皮肤紧致，无脱屑、出血现象。

2.2 对小鼠皮肤含水量的影响：如图2所示，与正常组比较，UVB组皮肤含水量明显降低（65.28% vs 59.39%），差异有统计学意义（P<0.05）。与UVB组比较，UVB+水母雪莲组皮肤含水量明显升高（59.39% vs 63.28%，P<0.05）。

2.3 小鼠皮肤组织HE染色结果：如图3所示，可发现正常组，皮肤结构完整，光滑，排列紧密;UVB组较正常组，表皮层异常增厚，角质层脱落严重，真皮层胶原纤维及弹力纤维缺失、断裂卷曲、结构松散、排列紊乱。相对于UVB组，UVB+水母雪莲组表皮无异常增厚，角质层相对完整真皮层排列有序，无错乱。

2.4 小鼠皮肤组织Masson染色结果：如图4所示，可发现UVB组，表皮与真皮层界限模糊，真皮层厚度明显变小，胶原纤维含量减少，甚至出现空洞;胶原纤维分布不均，含量减少，出现断裂，排列紊乱。UVB+水母雪莲组真皮层厚度正常，胶原纤维分布均匀，排列紧密整齐。

2.5 对小鼠水通道蛋白3通路的影响：如图5所示，UVB组P-EGFR与P-ERK的蛋白表达量要高于正常组，AQP3的表达量低于正常组;UVB+水母雪莲组P-EGFR与P-ERK的表达量低于UVB组，AQP3的表达量高于UVB组。

2.6 免疫组化：如图6～7所示，UVB组AQP3的阳性表达区域明显低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）;UVB+水母雪莲组AQP3的阳性表达区域高于UVB组，差异有统计学意义（P<0.05）。

3  讨论

青海省作为中国的高海拔地区，紫外辐射极强，当地居民长期生活在此环境中抵抗力低，受到紫外线直接照射后，容易引起一系列的疾病，尤其是光损伤性皮肤病。简便，有效的预防与治疗方法是人们迫切需要的[11-12]。水通道蛋白（AQPs）是促进水通过细胞膜的通道，其中AQP3是皮肤中最丰富的AQP，在表皮的棘层和基底层大量表达，起着水和甘油转运蛋白的作用[13]。AQP3运输的甘油在角质层水化中发挥重要作用，通过促进各种脂类的生物合成，改善屏障功能和加強皮肤修复能力，所以笔者通过AQP3通路治疗光老化损伤是一种新的尝试。

本实验通过注射D-半乳糖和UVB照射的联合作用下，最大限度地制作了小鼠皮肤衰老模型[14]。经过水母雪莲多糖治疗的UVB+水母雪莲组小鼠，皮肤较UVB组损伤小，皮肤色泽均匀，光滑不粗糙，无脱屑，结痂等症状，皮肤含水量提升明显。在HE染色下，UVB+水母雪莲组的表皮层与真皮层界限清晰，表皮无异常增厚，且恢复了真皮层正常厚度。在Masson染色下，UVB+水母雪莲组小鼠胶原纤维与弹性纤维，排列整齐，缺失与断裂情况大幅度降低。这证实了水母雪莲多糖能有效修复皮肤真皮与表皮层的损伤。

据国内外相关研究发现，紫外线照射可以通过活化大量ERK，减少AQP3来损伤皮肤组织，造成皮肤光老化[15]。本实验结果显示经过处理后的UVB组，EGFR磷酸化而激活，进而激活ERK引起一系列皮肤氧化损伤，导致胶原蛋白等降解，皮肤屏障功能衰退。同时AQP3的表达在皮肤的棘层与基底层也降低，使皮肤含水量降低，皮肤稳态失衡，伤口的愈合能力显著下降。UVB+水母雪莲组EGFR与ERK的表达水平低于UVB组，AQP3的表达水平高于UVB组，得到了很好的恢复。这更加证明了药物有很好的疗效。水母雪莲多糖通过使EGFR，ERK的减少，AQP3的增多抵御了皮肤的衰老与损伤。但是这个结论和部分学者[16-17]的结论有些许出入，ERK到AQP3通路的具体机制还不清晰，特别是在皮肤组织上的相关信号通路还有待钻研。如今，对于光老化方面的研究越来越多，但是对更加深入的具体机制研究尚且不足，这个也是后续研究要去努力探索的方向。

水母雪莲多糖通过抑制ERK活性，上调AQP3的表达量与活性，从而改变皮肤表皮与真皮层厚度、纤维形态来起到治疗皮肤衰老，加强皮肤屏障功能作用，且AQP3在防御皮肤光老化方面起到了重要作用。作为人类使用的光老化预防剂，植物抗氧化剂和天然化合物受到了相当大的关注，本次研究也为防紫外线药物的研发提供了新的方向与实验基础。

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[收稿日期]2020-11-09

本文引用格式：曾智，孔悦，郭砚.水母雪莲多糖对UVB诱导的小鼠皮肤损伤保护作用的机制研究[J].中国美容医学，2021，30（4）：102-106.