南芥菜花叶病毒衣壳蛋白的克隆、原核表达和多克隆抗体制备

苏学思，张玉宝，王亚军，郭志鸿，邱 阳，唐国亮

(1.中国科学院 西北生态环境资源研究院，兰州 730000；2.中国科学院大学，北京 100049；3.甘肃省生态与农业综合试验野外科学观测研究站，兰州 730000)

南芥菜花叶病毒(Arabismosaicvirus，ArMV)属于伴生豇豆病毒科(Secoviridae)豇豆花叶病毒亚科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)成员，是危害花卉、果树、蔬菜等经济作物的主要病原，是列入中国进境检疫名录的二类植物病毒[1]。ArMV病毒颗粒呈正二十面体结构，基因组由两条正义单链RNA组成，编码两个开放阅读框(Open reading frame，ORF)[2]。ORF1由2 284个氨基酸多肽组成，编码一个多聚蛋白，经蛋白酶剪切后共形成6个成熟的蛋白，分别为X1，X2，NTB，VPg，Pro，Pol[3]。ORF2包含有1 083个氨基酸多肽，也编码一个多聚蛋白，剪切后形成病毒的归巢蛋白(Homing protein，HP)、运动蛋白(Movement protein，MP)和衣壳蛋白(Coat protein，CP)[4]。

ArMV寄主广泛，可以侵染约174属215种植物，其中如烟草、草莓、葡萄、大豆、番茄等皆为中国广泛种植的重要经济作物[5]。ArMV所引起的病毒病症状主要表现为叶片花叶、斑驳、黄化，严重则表现为矮化、畸形、坏死等，显著降低作物的产量和品质[6]。百合(Lilium)是一种集观赏、食用和药用价值于一体的重要经济作物，近年来被发现是ArMV的新寄主[7-8]。百合感染ArMV后，除叶片和植株表现出上述症状外，种球部位还会出现坏死斑[9]。即便寄主相同，症状也会随着株系、栽培品种、季节以及年份不同而发生变化。

为了有效控制ArMV的危害，并且制定出准确、高效的防治策略，迫切需要开发出快速高效的病毒检测技术。血清学方法因为特异性强、灵敏度高、检测速度快、大样本检测等优点，被作为田间最常用的病毒检测方法[10]。然而提取病毒粒子为抗原的传统方法，制备抗体存在着特异性差、效价低的问题[11]。近年来，运用分子生物学的方法，构建基因原核表达载体，诱导表达病毒蛋白，以此为抗原制备抗体的技术已经发展成熟，获得的抗体具备很高的特异性和效价，被广泛应用于植物病毒的抗体制备。

病毒基因组分析表明，ArMV无包膜蛋白(Envelope protein，ep)，其CP蛋白在维持病毒生存及病毒侵染寄主的过程中发挥着关键性作用[2]。目前，国内关于ArMV CP蛋白原核表达的研究，均是以部分CP基因为对象，在分析CP蛋白的结构和功能时存在不足[12-13]。因此，选择克隆ArMV CP基因全长，诱导表达出具备完整结构和功能的CP蛋白，将为研究ArMV的致病机理奠定基础。

本研究从感染ArMV的百合中克隆ArMV CP基因全长，构建ArMV CP基因的原核表达载体，转化E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导表达，获得大量高纯度的ArMV CP蛋白，并以此为抗原制备高特异性的多克隆抗体，以期为ArMV的血清学检测技术开发和致病机理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

带毒东方百合杂交品种‘木门’(‘Conca D’or’)叶片采自中国科学院西北生态环境资源研究院皋兰生态与农业综合试验站(36°13″N，103°47″E)，经RT-PCR检测[8,14]，获得分别感染百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、百合斑驳病毒(Lilymottlevirus，LMoV)、车前草花叶病毒(Plantagoasiaticamosaicvirus，PlAMV)和ArMV的百合样品，-70 ℃保存。

植物总RNA提取试剂盒(RNAprep Pure Plant Kit)购自天根生化科技(北京)有限公司；植物蛋白提取试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司；质粒微量抽提试剂盒(E.Z.N.A.○RPlasmid DNA Mini Kit Ⅰ)购自Omega公司；逆转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)、DNA回收试剂盒(Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit)和克隆载体pMDTM19-T购自宝生物工程(大连)有限公司；Ni-NTA预装重力柱(Ni-NTA Pre-Packed Gravity Column)和NBT/BCIP碱性磷酸酶显色试剂盒(蓝色)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)菌株以及表达载体pET-28a(+)由甘肃省寒区旱区逆境生理与生态重点实验室保存。

1.2 引物设计与合成

根据已经公布的百合ArMV CP基因序列(GenBank登录号：KJ481187)设计合成特异性引物。为便于表达克隆化基因，分别在正向和反向引物上添加BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位点，引物序列如下(下划线表示引入的酶切位点)：

正向引物：5′-GGATCCGGTCTTGCTGGTAGAGGTTCTG-3′

反向引物：5′-CTCGAGAACTTTAAAGCATGTTCTTCCGTA-3′

以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 ArMV CP基因的PCR扩增

使用植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，以提取的总RNA为模板，按照试剂盒说明逆转录合成cDNAs，然后 PCR扩增ArMV CP基因。PCR扩增条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，循环扩增30次；72 ℃延伸7 min。扩增完毕，PCR产物经 15 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段通过DNA回收试剂盒纯化。

1.4 重组克隆载体的构建

纯化片段连接T载体，转化E.coliDH5α。用质粒微量抽提试剂盒提取质粒，PCR筛选阳性克隆。阳性质粒经BamH Ⅰ和XhoⅠ切割， 15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，将酶切及凝胶电泳鉴定为阳性的质粒送交北京擎科新业生物技术有限公司测序，证实序列正确后命名为pMD19-T-ArMV。将测序获得的CP序列提交GenBank，借助BLAST、ClustalW和DNAStar软件进行序列比对、分析以及ArMV CP蛋白的抗原表位 预测。

1.5 重组原核表达载体的构建

pMD19-T-ArMV质粒和pET-28a(+)质粒经BamH Ⅰ和XhoⅠ切割，回收目的片段， 16 ℃连接过夜。连接产物转化E.coliDH5α，涂布平板。挑取单克隆过夜培养，PCR筛选阳性克隆。提取质粒，经BamH Ⅰ和XhoⅠ切割，鉴定正确后命名为pET-28a-ArMV。未经酶切处理的重组质粒作为阴性对照。

1.6 ArMV CP蛋白的原核表达

阳性质粒pET-28a-ArMV转化E.coliBL21(DE3)，接种至含有50 μg/mL Kana的LB液体培养基，37 ℃培养过夜。次日按1∶100接种于相同培养基，37 ℃培养至OD600达到0.7时添加1.0 mmol/L IPTG诱导，37 ℃振荡培养，分别于3、4、5、6、7 h收集菌体进行SDS-PAGE电泳。未插入目的片段的空质粒诱导蛋白和未经IPTG诱导的重组菌蛋白作为阴性对照。

按相同的培养条件，诱导培养1 L菌体。菌体经0.01 mol/L PBS溶液悬浮、超声破碎、离心后，取上清。按照Ni-NTA重力柱操作指南纯化目的蛋白。

1.7 ArMV CP多克隆抗体的制备

用1 mg/mL 的ArMV CP纯化蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔。初次免疫中，将1 mg纯化蛋白和完全弗氏佐剂等量混合均匀，进行皮下多点注射。两周后进行增强免疫，将等体积的抗原和不完全弗氏佐剂充分混匀，进行皮下多点注射。每间隔两周进行1次增强免疫，第4次增强免疫1周后颈动脉采血，分离得到抗血清。收集到的血清借助饱和硫酸铵沉淀法和DE52阴离子交换柱层析法进行纯化，从而获得兔抗ArMV多克隆抗体IgG。

1.8 ArMV CP多克隆抗体的鉴定

称取0.1～0.2 g分别感染LSV、CMV、LMoV、PlAMV及ArMV的百合叶片组织，加入液氮研磨，按照植物蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白。蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后， 15 V恒压转移至PVDF膜，转膜后移入1%酪蛋白封闭液中，4 ℃过夜封闭。以制备的ArMV CP多克隆抗体作为一抗(1∶10 000)，AP标记的羊抗兔IgG作为二抗(1∶20 000)，通过NBT/BCIP碱性磷酸酶显色试剂盒(蓝色)显色。

2 结果与分析

2.1 ArMV CP基因的克隆

以侵染东方百合杂交品种‘木门’(‘Conca D’or’)的ArMV的基因组RNA为模板，PCR扩增ArMV CP基因。电泳检测结果显示，得到的扩增片段大小为1.0～2.0 kb，符合预期(1 515 bp)(图1)。将扩增的ArMV CP序列克隆于pMD-19T载体，测序结果显示ArMV CP序列的长度为1 515 bp，编码505个氨基酸组成的CP蛋白，推测蛋白质相对分子质量为56 ku。NCBI上提交克隆所得序列，获得的登录号为MT323117。

2.2 ArMV CP基因的序列分析

将克隆的百合ArMV CP基因与GenBank中不同分离物的ArMV CP基因核苷酸及氨基酸序列进行比较。BLAST结果表明，百合ArMV CP基因的核苷酸和氨基酸序列均与采自波兰的R14_3分离物(MH316599)的相似性最高，分别为93.6%和98.2%；与其他分离物的核苷酸序列相似性为81.6%～93.5%，氨基酸序列相似性为92.2%～97.6%；与已注册的7个百合分离物(AB279741、KJ481182、KJ481183、KJ481184、KJ481185、KJ481186和KJ481187)相比，核苷酸序列相似性为89.4%～90.2%，氨基酸序列相似性达到95.5%～96.4%。

借助DNAStar软件分析百合ArMV CP蛋白的二级结构、亲水性和柔韧性，并预测其抗原表位(图2)；将71个不同分离物的ArMV CP蛋白氨基酸序列进行ClustalW比对，获得ArMV CP中相似性达到90%的保守位点。在抗原性指数较高(指数≥0)的区域，选取亲水性好(指数≥0)且具有β转角或无规则卷曲结构的区域作为潜在的抗原表位(氨基酸数≥4)，对比抗原表位和保守位点的氨基酸组成，发现抗原表位所包含的61个氨基酸中保守位点占据85.2%，表明ArMV CP蛋白的抗原表位保守。

2.3 重组原核表达载体的构建

pET-28a重组质粒经PCR扩增得到约1.5 kb的条带，长度与ArMV CP基因全长保持一致(1 515 bp)。用BamH Ⅰ和XhoⅠ切割pET-28a重组质粒，电泳检测结果显示，重组质粒被切割成两条带，分别与PCR产物(1.5 kb)和pET-28a质粒(5 kb)的大小一致(图3)。

2.4 ArMV CP蛋白的原核表达

阳性质粒pET-28a-ArMV转化E.coliBL21(DE3)菌株，经1.0 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE分析，观察到目的蛋白有明显表达(图4)。但随着诱导时间从3 h增加到7 h，目的蛋白表达量没有显著变化。

2.5 Western blot免疫印迹

提取百合叶片总蛋白，经Western blot检测，发现抗体与感染ArMV的样品在预期大小的位置处发生特异性反应，而与健康百合样品以及分别感染LSV、CMV、LMoV、PlAMV的样品无交叉反应，表明抗体能够特异性结合ArMV CP蛋白，具有很好的特异性(图5)。

3 讨 论

贸易全球化推动了中国经济的发展，但是也为国内生物安全带来挑战，近些年来，海关不断从进境的百合、水仙、郁金香等花卉植物上检测到ArMV[15-16]。目前，该病毒的防治主要依赖于快速灵敏的血清学检测技术，相较于核酸检测技术，前者的优点在于避免病毒RNA提取的困难，操作简便，并且适用于大规模的田间检测。病毒CP蛋白在原核表达中具有较好的免疫原性，因此通常被作为抗体制备的抗原，同时借助原核表达也避开直接纯化病毒所面临的难题[17-18]。然而，国内学者选取部分ArMV CP基因进行原核表达，没有注意到CP结构和功能的完整性。于翠等[15]使用商业化的多克隆抗体建立DAS-ELISA技术体系，从水仙种球上检测到ArMV。一方面，商业化抗体相较于本研究所制备的抗体，对于检测百合上ArMV的特异性可能有所降低；另一方面，ELISA检测的结果存在非特异性的可能，无法应用于病毒蛋白表达分析，不能满足ArMV致病机理研究的需要。本研究在此基础上，克隆CP全长基因，表达具备完整结构与功能的CP融合蛋白。序列分析结果表明ArMV不同分离物的CP序列相似性高，抗原表位保守，因此以纯化ArMV CP蛋白为抗原制备多克隆抗体，可用于检测感染不同宿主的ArMV。此外，本研究制备的抗体效价高，建立的Western blot方法能够用于分析病毒蛋白的表达量，可用于病毒蛋白功能的分析及致病机理的研究。

为了提高目的蛋白表达量，获得优异的抗体，对重组蛋白诱导表达条件进行初步摸索。本研究设置蛋白诱导表达的时间梯度，探究诱导时间和蛋白表达量的关系。SDS-PAGE结果表明，增加诱导时间，ArMV CP蛋白表达量没有发生明显变化(图4)。这个结论与王玉等[19]的研究并不一致，可能与两者所用诱导剂的浓度差异有关。本研究用于诱导蛋白表达的IPTG为1.0 mmol/L，相比0.2 mmol/L浓度明显偏高，这可能会抑制菌体的生长[20]，从而使目的蛋白的表达量在3 h达到峰值。

然而在优化诱导时间后，发现本研究获得的ArMV CP蛋白表达量并不高，推测其原因可能与表达载体及密码子偏性有关。谷红等[21]构建不同的原核表达载体，发现PRRSV dORF5(去掉N端疏水序列)在pGEX-4T-2表达载体中能够大量表达，而在pET-28a和pET-5a中不表达。即表达载体影响蛋白的高效表达，CP蛋白表达量低可能受到载体的影响。卢海强等[22]根据毕赤酵母的密码子偏好性，优化嗜热甘露聚糖酶ManBK的基因序列，并以此构建pPIC9K表达载体，得到高浓度的嗜热甘露聚糖酶。密码子偏性是普遍存在的现象，ArMV和大肠杆菌的密码子偏性不同，这可能是制约CP蛋白表达的原因。

蛋白纯化和抗体特异性检验也可以进行优化，从而提高抗体制备的效率。Ni-NTA柱亲和层析纯化时，最初获得的纯化蛋白浓度较低，后来在蛋白上样之后增加孵育过程，即在4 ℃下孵育4～10 h，使目的蛋白与柱子的结合更加充分，显著提高纯化蛋白含量。Western blot鉴定抗体特异性的过程中封闭是非常重要的环节之一，只有背景干净的显色结果才具有说服力。尤其是对于化学显色检测系统，因检测灵敏度极高，对背景信号的要求非常严格。本研究最初选择脱脂奶粉和BSA作为封闭剂，但是显色结果中均出现较高的背景，这可能是因为脱脂奶粉和BSA自身具有的一定的碱性磷酸酶活性造成的结果[23]。为消除内源性的碱性磷酸酶活性，选择酪蛋白作为封闭剂，成功降低显色背景，验证多克隆抗体的特异性[24]。

ArMV是世界上一种重要的植物病害，本研究构建ArMV CP基因原核表达载体，制备ArMV CP蛋白的多克隆抗体，可以为ArMV的血清学检测和致病机理的研究提供一定参考。