VEGF在绵羊卵巢中的表达分布研究

2021-07-15柴雅静余晓雪乔自林

甘肃畜牧兽医 2021年6期

柴雅静，余晓雪，杨琨,2*，乔自林,2,3

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730030；2.西北民族大学生物医学研究中心/甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃兰州 730030；3.西北民族大学生物医学研究中心/生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州 730030）

血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）又称为促血管因子（vascul-otropin，VAS），它对血管内皮细胞的增殖分裂等起到促进作用，可以使血管对一些大分子物质的通透性增强，刺激新血管生成，在生殖过程中也具有独特作用[1-3]。形态学研究证明，卵泡的发育和血管的发生是密不可分的。卵泡周围的血管网越密集，卵泡可吸收的营养就越多，发育就越快。反之，发育受阻形成闭锁卵泡[4]。

该实验以绵羊卵巢为实验材料，通过HE染色和免疫组织化学染色的方法检测血管内皮生长因子（VEGF）在绵羊卵巢中的表达及定位的特异性，为绵羊卵巢的卵泡发育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

该实验所需材料为绵羊的卵巢，于甘肃省兰州市屠宰场采集健康绵羊卵巢组织样本，经宰割后立即采取组织样本并放入4%多聚甲醛中固定。

1.2 材料处理

按照石蜡包埋的常规方法先取绵羊卵巢组织中的卵泡，对其形状修整后进行石蜡包埋，切成厚度为4～5 μm的组织切片，最后对切片进行HE染色以及免疫组织化学染色。

1.3 主要试剂

兔SP试剂盒（SP-0023）、VEGF多克隆抗体（兔）（bs-1665R）以及DAB染色试剂盒（C02-04001），均购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.4 HE染色

将已经固定好的卵巢组织用水冲洗、梯度脱水、透明后进行浸蜡包埋，制作组织切片，然后进行脱蜡水化、染色、分化、脱水透明、封片等HE常规染色步骤。镜下观察绵羊卵巢组织结构的完整性及其结构特点。

1.5 免疫组织化学SP染色

将组织切片脱蜡水化，随后抗原修复、阻断、封闭，而后滴加一抗置于湿盒内4℃过夜孵育，PBS缓冲液洗涤后用二抗孵育。配置DAB显色液进行显色并观察，显色终止后用苏木精进行复染，封片镜检。

1.6 结果判定

镜检结果中，DAB显色阳性表达为棕黄色，通过棕黄色表达的深浅及面积可判断VEGF表达的强弱。

2 结果

2.1 绵羊卵巢的组织学结构

图1A可见初级卵泡，结构完好，初级卵母细胞与卵泡细胞之间有透明带，卵泡周围有卵泡膜[5]。图1B可见次级卵泡，卵泡细胞间出现腔隙（卵泡腔），可见卵丘[6,7]。由此可知，该绵羊卵巢结构完好，发育健康良好，无不良病变。

图1 绵羊卵巢组织HE染色结果

2.2 血管内皮生长因子在绵羊卵巢中的表达

在绵羊卵巢中，免疫组织化学染色结果显示VEGF主要在各级卵泡中表达。由图2可知，VEGF在原始卵泡、初级卵泡以及次级卵泡中都为阳性表达。由表达的深浅不同可知，VEGF在次级卵泡中表达最强，初级卵泡中表达效果次之，原始卵泡中表达最弱，且VEGF主要在初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞以及卵泡膜细胞的胞质中表达，在细胞核内无表达。

图2 绵羊卵巢免疫组织化学染色检测结果

3 讨论

血管内皮生长因子是关于血管生成的关键调节因子。血管在卵泡发育初期就开始生成，且在整个卵泡发生过程中是持续的。卵巢中卵泡的发育可分为筹募、选择和优势化3个过程。在卵泡优势化时期，高表达量的VEGF会促进血管的生成，给正在发育的卵泡提供更为丰富的营养，使卵泡更加快速地生长发育[8]。

排卵前，卵泡的膜细胞层中会形成大量血管，由于VEGF的表达强度与卵泡中的血管生成和发育有着密切关联[9]，因此可推测本研究结果中颗粒细胞和膜细胞分泌的VEGF可能促进了膜细胞层血管内皮细胞的增殖。

1999年，Otani[9]等人通过免疫组织化学方法研究证实，在人的卵泡中VEGF是存在免疫定位的。VEGF在小腔卵泡的颗粒细胞中表达较弱，在中型卵泡的膜细胞中表达较强，其颗粒细胞和卵泡膜细胞的表达强度会随着卵泡的生长发育逐渐增强。本实验认为VEGF在绵羊卵巢中的表达主要分布于各级卵泡，其中在窦腔期卵泡中的表达比原始卵泡中多，且VEGF主要在颗粒细胞以及卵泡膜细胞的胞质中表达。