响应面法优化酶-超声波辅助提取恒山黄芪总皂苷工艺

张弘弛，付莉媛，周凤，李慧，刘瑞*

（1.大同大学生命科学学院，山西 大同 037009；2.大同大学应用生物技术研究所，山西 大同 037009）

黄芪主要分布于我国山西、内蒙古和甘肃，其中被誉为“黄芪王”的恒山黄芪产于山西浑源恒山地区。恒山黄芪茎状均匀、平滑、顺直，横截面颜色偏亮黄，为中国北芪之正宗。 黄芪除具有广泛食疗价值[1]，还具有广泛的药理作用[2]，配合其它中药的服用更能发挥其功效，具有良好的降压、利尿、保肝等作用，还能增强人体免疫力[3]。 黄芪中的药效成分主要为皂苷，黄芪中皂苷含量丰富，且类型多样，但是传统的溶剂提取法，如水煎煮中药材法、乙醇溶剂提取法、超声波辅助提取法等[4]提取效果低于预期，而新兴的酶法提取活性物质，已有成功的研究成果，如果胶酶提取绞股蓝皂苷新工艺与传统碱水提取工艺相比，收率大幅提高[5]，酶是具有专一性、催化效率高等特点的生物催化剂[6]，可以破坏植物细胞壁中的纤维素成分，纤维素酶将纤维素水解为葡萄糖[7]，果胶酶可以破坏细胞壁中的果胶质，达到破碎植物细胞壁的目的，让胞内物质释放[8-9]。

本研究拟尝试用一种新的方式——酶结合超声波辅助法提取黄芪中的总皂苷， 结合响应面法考察酶添加量、乙醇浓度、超声时间、超声温度以及pH 值对黄芪中总皂苷提取效果的影响。在前期研究基础上加入新的工艺以期为黄芪总皂苷提取提供新的工艺方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

恒山黄芪根（粉碎后试验）：山西浑源万生黄芪开发有限公司；黄芪甲苷对照品（编号Z0371312）：北京谱析科技有限公司；纤维素酶（3 U/mg）：和氏璧生物科技有限公司；果胶酶（30 U/mg）：上海蓝季生物有限公司；淀粉酶（1 U/mg）：山东隆科特有限公司；浓硫酸：招远市大明仪表有限公司；香草醛：北京创煌伟业食品配料有限公司；无水乙醇：湖北新河原药有限公司；甲醇：中煤龙化哈尔滨煤化工有限公司；以上所有试剂均为分析纯。

XFB-200 型小型中药粉碎机： 吉首中诚制药厂；HH-3S 三孔三控温水槽：常州市英格尔仪器制造有限公司；T650CT 双头恒温超声波提取机： 上海左乐仪器有限公司；SHB-IIIA 型循环水式多用真空泵： 郑州长城科工贸有限公司；RE-2000E 型旋转蒸发器：西安禾普生物科技有限公司；UV-3200S 紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黄芪总皂苷标准曲线的绘制

准确称量黄芪甲苷对照品12.5 mg，用适量甲醇充分溶解，置入25 mL 容量瓶定容备用，即为黄芪甲苷的标准溶液（浓度为0.5 mg/mL）。 精确量取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL 上述黄芪甲苷标准溶液， 加入适量甲醇使得溶液总量为0.5 mL， 取质量分数为8%的香草醛无水乙醇溶液2.5 mL 分别加入至试管中，振荡均匀，置于62 ℃恒温水浴中，温热后于每只试管中加入2.5 mL 体积分数为72%的硫酸（不断振荡防止局部温度过高）。保温20 min，冷水浴中保持10 min。将0 号试管中的待测液作为空白对照，30 min 内，紫外分光光度计波长设定540 nm[10]，测吸光度值并记录。

1.2.2 黄芪中总皂苷的提取

取各试验中提取液， 置于沸水浴进行酶的灭活，待冷却至室温（25 ℃）后过滤，加甲醇稀释，依据1.2.1中硫酸-香草醛-无水乙醇法检测，将所得吸光度值代入标准曲线回归方程， 求得溶液中的总皂苷浓度，并且按照下述公式计算出黄芪总皂苷提取率。

式中：W 为总皂苷的提取率，%；c 为根据标准曲线回归方程所计算出的溶液浓度，mg/mL；D 为溶液稀释倍数；V 为待测溶液的体积，mL；m 为材料质量，mg。

1.2.3 酶制剂的选择

精确称取3 份1.0 g 黄芪分别放置100 mL 烧杯中，分别加入占原材料质量5%的纤维素酶、果胶酶、淀粉酶，把未加入任何酶制剂的样品作为对照。 将每份样品中加入50 mL 体积分数为70%乙醇溶剂，将上述各样品置于温度为45 ℃、超声功率200 W、超声时间为30 min、pH 6 的环境中处理，完成酶解后，沸水浴中进行5 min 酶的灭活，待冷却至室温（25 ℃），离心得到上清液。 采用硫酸-香草醛-无水乙醇法进行检测，测定其吸光度值并记录，计算总皂苷提取率。

1.2.4 单因素试验

采用1.2.3 的方法提取黄芪总皂苷，基础提取试验条件为：pH 6、设定超声功率1 000 W、超声时间30 min、固定超声温度为45 ℃、乙醇浓度为70%、乙醇溶剂用量为50 mL 以及酶添加量为5%。 各单因素变量设定为：酶添加量（1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%）、乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、超声时间（10、20、30、50、70 min）、超声功率（800、1 000、1 200、1 500、2 000 W）、超声温度（35、40、45、50、55、60 ℃）、pH 值（3.5、4、4.5、5、5.5、6）。采用硫酸-香草醛-无水乙醇法检测吸光度值，计算总皂苷提取率。

1.2.5 响应面试验

以单因素试验为基础，基于Box-Behnken 的中心组合设计原理[11-13]，响应面分析优选酶-超声波辅助提取黄芪总皂苷的最佳提取条件。 以黄芪总皂苷提取率为响应值，选择酶添加量、乙醇浓度、超声时间、超声温度及pH 值为考察因素自变量， 设计五因素三水平响应面法优化提取工艺，自变量的低、中、高水平分别用-1、0 和1 表示，因素与水平见表1。

表1 响应面因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3 数据的处理

运用软件Design-Expert 8.0.6 进行方差分析，用Origin 8.0 软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 黄芪总皂苷标准曲线

用最小二乘法对所得结果进行线性回归，可得黄芪甲苷溶液浓度c（mg/mL）与吸光度值A 的回归方程式为：A=1.907c-0.824（R2=0.991 5）。

2.2 酶制剂筛选的结果

酶制剂筛选结果见图1。

图1 酶制剂筛选Fig.1 Enzyme preparation screening

由图1 可知，纤维素酶提取总皂苷提取率最高，果胶酶对黄芪总皂苷的提取略低一些，淀粉酶最低。 植物细胞壁的主要成分是纤维素、 半纤维素和果胶，试验结果表明纤维素的分解率是影响黄芪细胞破碎的主要因素，因而本研究确定使用纤维素酶作为细胞破碎的生物酶。

2.3 单因素的试验结果

2.3.1 纤维素酶添加量对黄芪中总皂苷提取率的影响

纤维素酶添加量对黄芪总皂苷提取率的影响见图2。

由图2 可知， 总皂苷的提取率随着酶添加量增加呈现先升高后平稳的趋势。 在酶添加量为原料总量的2%时，达到最大值。 因此为进一步了解酶添加量对总皂苷提取效果的影响，选择酶添加量为1%、2%、3%进行响应面试验设计。

图2 纤维素酶添加量对总皂苷提取率的影响Fig.2 Effect of the amount of compound enzyme on the extraction rate of total saponin

2.3.2 乙醇浓度对黄芪总皂苷提取率的影响

乙醇浓度对黄芪总皂苷提取率的影响见图3。

图3 乙醇浓度对总皂苷提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total saponins

由图3 可知， 随乙醇浓度增加总皂苷的提取率逐渐增加。 乙醇浓度越高对于黄芪总皂苷的提取效果越好，但后期增长趋势不明显。 为进一步研究乙醇浓度对黄芪总皂苷提取率的影响， 选择乙醇浓度为90%、95%、100%进行响应面试验设计。

2.3.3 超声时间对黄芪总皂苷提取率的影响

超声时间对黄芪总皂苷提取率的影响见图4。

图4 超声时间对总皂苷提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of the total saponins

由图4 可知，超声时间在20 min 内，总皂苷的提取率呈现快速上升的趋势，但是随着超声时间延长提取率反而趋于平衡甚至略微降低，可能的原因是超声波时间累积量对细胞的破碎趋于平衡，因而总皂苷的提取率在长时间超声后，变化很小。 因此选取10、20、30 min 进行响应面试验设计。

2.3.4 超声功率对黄芪中总皂苷提取率的影响

超声功率对黄芪总皂苷提取率的影响见图5。

图5 超声功率对总皂苷提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of the total saponins

由图5 可知，超声功率从800 W 上升至2 000 W，总皂苷的提取率波动在0.25%左右， 在合适的酶分解条件下， 超声功率累积量对细胞的破碎几乎没有影响，因而总皂苷的提取率变化很小。 因此在后续响应面试验设计中，超声功率不再作为考察因素。

2.3.5 超声温度对黄芪总皂苷提取率的影响超声温度对黄芪总皂苷提取率的影响见图6。

图6 超声温度对总皂苷提取率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of the total saponins

由图6 可知，总皂苷的提取率在温度为50 ℃时出现一个峰值，在峰的两侧总皂苷的提取率变化急剧下降。 从酶本身的性质出发，可以发现在峰值两侧，越偏离峰值酶的活性越低，在峰的右侧，总皂苷提取率下降较快，可能由于温度的提升致使酶活性的降低，而导致分子中的皂苷不能得以释放，因而总皂苷提取率降低。 为进一步研究超声温度对总皂苷提取率的影响，分别在超声温度为40、50、60 ℃进行响应面试验设计。

2.3.6 pH 值对黄芪总皂苷提取率的影响

提取液pH 值对黄芪总皂苷提取率的影响见图7。

图7 pH 值对总皂苷提取率的影响Fig.7 Effect of pH on extraction rate of the total saponins

由图7 可知，随着pH 值不断增加，黄芪总皂苷的提取率呈现出先增加到峰值接着急剧下降之后又缓慢上升，存在两个极值点（可能是提取体系中不同因素影响了纤维素酶的酶促反应的最适合pH 值而导致），但是在pH 值为4 时到达最值。 提取率出现下降趋势的原因可能是超过酶的最适pH 值环境， 导致酶活力的下降或失活。 因此为进一步探索pH 值对总皂苷提取率的影响， 故选择pH 值分别为3.5、4.0、4.5 进行响应面试验设计。

2.4 响应面试验

2.4.1 响应面试验结果分析

综合利用单因素试验所得结果，根据Box-Behnken的中心组和设计原理[11-13]。 以黄芪总皂苷提取率作为考察的指标，综合选取ApH 值、B 超声时间、C 超声温度、D 乙醇浓度及E 酶添加量这5 个因素设计五因素三水平响应面试验，试验结果见表2，回归系数显著性检验见表3。

将表2 中所得数据处理后， 可得5 个自变量与黄芪总皂苷提取率的回归方程为： 总皂苷提取率=3.26-0.36A+0.29B+0.010C-0.030D+0.15E+0.030AB-0.045AC+0.12AD+0.16AE-5×10-3BC-0.27BD+0.065BE-0.15CD-0.12CE-0.050DE-0.34A2-0.16B2-0.32C2-0.13D2-0.41E2-0.16A2B+0.24A2C-0.045A2D-0.53A2E+0.44AB2+0.64AC2+0.38AD2+5×103B2C-0.32B2D+0.025B2E+0.090BC2-0.15 BD2-0.100C2D+0.060C2E-0.020CD2。

表2 响应面试验方案与结果Table 2 Design and experimental results of response surface experiment

据表3 可知回归模型的方差分析结果，其中，模型P=0.000 5＜0.01，方程模型极显著，其失拟项P=0.355 7＞0.05，其失拟不显著。 上述回归模型总决定系数R2为0.967 7， 调整决定系数R2Adj是0.854 5， 变异系数CV为5.3%，由此可说明，不论是在拟合性方面还是误差范围方面，该模型均体现出较好的状态，故上述回归方程模型可以作为参考，能够用于黄芪总皂苷纤维素酶解-超声波辅助提取条件的分析以及预测。 模型的一次项A（pH）、B（超声时间）极显著（P＜0.01）；二次项A2、C2、E2达高度显著水平（P＜0.000 1），B2、D2处于显著水平（P＜0.05）。 在5 个影响因素之中，pH 值对提取黄芪总皂苷效果的影响是最强烈的，其次是B-超声时间、E-纤维素酶添加量、D-乙醇浓度和C-超声温度。经过Design-Expert 8.0.6 优化， 通过对回归模型求解方程， 得出纤维素酶-超声波辅助法提取恒山黄芪总皂苷最优工艺条件是：pH 值为4.5， 乙醇浓度90%，超声时间30 min，超声温度为50 ℃，2%的纤维素酶添加量。 在这个条件下，黄芪总皂苷的提取率为4.51%。

表3 回归系数显著性检验Table 3 Significant of regression coefficient

2.4.2 交互项拟合响应值分析

Design-Expert 所得出各因素的交互影响图分析，各水平轴表示不同因素的变量，Z 轴表示响应值，建立3D 响应面图见图8，在响应面图中，坡面的平缓程度表明影响因素的效果。

图8 超声温度和纤维素酶制剂添加量交互作用对黄芪总皂苷提取率影响的等高线图和响应面图Fig.8 Response surface and contour map of ultrasonic temperature and cellulase dosage on the extraction rate of total saponins of Astragalus membranaceus

如图8 所示， 超声温度和纤维素酶添加量的等高线图更接近于椭圆，说明二者之间的交互作用更加显著，这一结果与文献[14]较为类似，而其它因素作用于提取率的效果则并不十分显著或没有显著性。

2.5 最优工艺条件的确定及验证

纤维素酶-超声波辅助法提取恒山黄芪总皂苷最优工艺条件是：pH 值为4.5，乙醇浓度90%，超声时间30 min，超声温度为50 ℃，2%的纤维素酶添加量。为验证Box-Behnken 试验设计的结果及其可靠性，在如上所述的最优工艺条件下，进行3 次平行试验，实测的提取率为（4.51±0.03）%，与预测值基本一致，因此，通过上述试验方法所得的最优提取黄芪中总皂苷的条件可靠，具有一定的试验参考价值及意义。

3 结论

本试验研究将纤维素酶法和超声波法结合，数据分析采用中心组合法，对黄芪中总皂苷的提取工艺条件进行了一定的优化。 考察了一系列因素对恒山黄芪总皂苷提取的影响，获得最佳工艺条件为pH 值为4.5，乙醇浓度90%， 超声时间30 min， 超声温度为50 ℃，2%的纤维素酶添加量。 在上述条件下，黄芪中总皂苷的提取率最大为4.51%。