中度嗜盐菌ST77及其萃取物对马铃薯干腐病的防效及菌株鉴定

沈 硕

(1.青海大学农林科学院；2.青海省马铃薯育种重点实验室；3.青藏高原生物技术 教育部重点实验室，青海 西宁 810016)

镰刀菌(Fusariumspp.)侵染马铃薯块茎后会引起马铃薯干腐病的发生，马铃薯干腐病是一种窖藏病害，其不仅严重危害贮藏期马铃薯种薯质量，还会影响下一年马铃薯出苗及随后的生长发育，从而大大降低马铃薯产量和商品价值[1-2].对马铃薯干腐病的防治主要依靠化学药剂，但化学防治存在环境污染、农药残留、菌株抗药等问题.我国于2016年提出“减化肥、减农药”的双减目标，微生物及其次级代谢产物由于具有无毒、无污染、可持续、活性优和可降解等显著优势，而成为植物病害生物防治和实现双减目标的重要选择[3].

国内外学者研究获得的马铃薯干腐病生防菌株主要包括放线菌(Actinomycesspp.)[4-7]、芽孢杆菌(Bacillusspp.)[8]和木霉菌(Trichodermaspp.)[9].此外，有学者研究了马铃薯非亲和菌株粉红单端孢(Trichotheciumroseum)菌丝细胞壁萃取物对马铃薯干腐病的拮抗作用[10].但有关嗜盐菌对马铃薯干腐病的抑制作用尚未见报道.嗜盐菌是一种极端环境微生物，有关来源于盐湖的中度嗜盐菌的研究主要包括新菌种的发现及鉴定、群落结构及多样性分析、植物病害及改善大肠杆菌的耐盐碱能力等[11-13].近年来，本研究小组从茶卡、察尔汗盐湖等区域发现了包括菌株ST77在内的大量具有农用活性的菌株.本试验对中度嗜盐菌ST77及其萃取物抑制马铃薯干腐病病原真菌的活性及活体防效进行研究，以期为先导化合物的分离鉴定及微生物源新型抗菌剂的研发提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：中度嗜盐菌菌株ST77分离自青海察尔汗盐湖湖泥样本；马铃薯干腐病病原真菌青9A-4-13(F.acuminatum)和青9A-5-2(F.solani)分离自马铃薯青薯9号薯块病样，病原真菌65B-2-6(F.trinctum)分离自马铃薯下寨65薯块病样.上述菌株保存于青海省农林科学院生物技术研究所，活化后备用.

供试培养基：ATCC213改良培养基[MgSO4·7H2O 10 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，KCl 5 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏10 g，NaCl 40 g，琼脂粉12 g(液体培养基不加琼脂粉)，加蒸馏水至1 000 mL，pH 7.2～7.4，在121 ℃下高压湿热灭菌25 min][11]；马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基[14].

供试马铃薯品种：青薯2号，为一级原种，由青海省农林科学院生物技术研究所提供.

1.2 方法

1.2.1 供试菌株的培养及ST77发酵液的制备 将菌株ST77划线接种于ATCC213改良培养基平板上进行活化，置于37 ℃培养箱中培养24 h.活化后的ST77菌株接种于ATCC213改良液体培养基中，置于37 ℃下200 r·min-1的摇瓶柜中培养5 d，收获发酵液.

将病原真菌青9A-4-13、青9A-5-2和65B-2-6分别接种于PDA培养基平板上进行活化，置于28 ℃培养箱中培养7 d后备用.

1.2.2 菌株ST77萃取物及其溶液的制备 将菌株ST77的发酵液分别用等体积的乙酸乙酯、氯仿和正丁醇在分液漏斗中萃取3次，萃取后的有机相合并后经减压旋转蒸发得到乙酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取物，备用.

称取适量的3种萃取物溶解于1 mL二甲基亚砜(DMSO)中，用无菌水分别将3种萃取物配成20 mg·mL-1的原液，在4 ℃下，经2 000 r·min-1离心、0.22 μm微孔滤膜抽滤后，用无菌水稀释为10、5和1 mg·mL-1的萃取物溶液，备用.

1.2.3 菌株ST77抑菌活性的测定 参照Sadfi et al[15]的方法，在直径9 cm培养皿底部用“十字交叉法”划线，并以交叉点为中心，中心点接种中度嗜盐菌ST77，在距离中心点2.5 cm呈对称分布的4个点接种直径5 mm的同一种病原真菌菌饼.每个培养皿为1个处理，每个处理重复3次，以只接种病原真菌的培养皿作为对照.分别在培养3、7和14 d后计算抑制率(inhibition rate， IR). IR=(R1-R2)/R1×100%，R1代表对照中病原真菌的生长距离，R2代表各处理中病原真菌的生长距离.

1.2.4 菌株ST77萃取物抑菌活性的测定 将牛津杯置于PDA培养基平板中央，分别加入1、5、10和20 mg·mL-1的萃取物溶液200 μL，在距培养皿中心2.5 cm呈对称分布的4个点接种待测的3种马铃薯干腐病病原真菌菌饼(6 mm).以只接种病原真菌菌饼的培养皿作为对照，每个处理重复3次，待对照平板长满菌落时测量抑菌带宽.抑菌率计算方法同1.2.3.

1.2.5 菌株ST77发酵液和萃取物对马铃薯活体防效的测定及其安全性评价 参照Sadfi et al[15]的方法，将活化好的供试马铃薯病原真菌接种至PDA液体培养基中，置于28 ℃下180 r·min-1的摇瓶柜中培养2 d；将活化好的菌株ST77置于37 ℃下200 r·min-1的摇瓶柜中培养2 d，分别收获发酵液.运用血球计数板测定病原真菌孢子数和菌株ST77细胞浓度，将病原真菌孢子浓度调整至1.0×107个·mL-1，将菌株ST77细胞浓度调整到1.0×108cfu·mL-1，备用.

选择贮藏于5～8 ℃下外观整齐、无病虫害的马铃薯青薯2号块茎，经自来水清洗，用2%次氯酸钠溶液浸泡2 min后立即用无菌水冲洗，自然晾干，用75%酒精进行表面消毒.在已消毒的马铃薯块茎上用直径为5 mm的打孔器均匀打2个深3 mm的孔.每个孔先接种40 μL病原真菌发酵液，再接入40 μL菌株ST77发酵液.以接种40 μL病原真菌发酵液和40 μL无菌水的处理为阳性对照，以接种40 μL菌株ST77发酵液和40 μL无菌水的处理为阴性对照.每个处理3个块茎，重复3次.用PE保鲜袋(30 cm×40 cm)包装接种完成的马铃薯块茎，放入温度28 ℃、相对湿度75%左右的恒温培养箱中培养.

14 d后测定马铃薯块茎的坏果率、病斑深度以及菌株ST77发酵液的抑制率.

抑制率/%=(LP-LA)/LP×100

LP=未经中度嗜盐菌处理的马铃薯块茎原质量-镰刀菌侵染后的质量，LA=中度嗜盐菌处理后的马铃薯块茎原质量-镰刀菌侵染后的质量.

菌株ST77萃取物对马铃薯活体防效的测定方法同上.

中度嗜盐菌对马铃薯贮藏安全性的评价方法参照文献[16-18].

1.2.6 菌株ST77的形态学鉴定 从培养基平板上刮取经活化的菌株ST77，用1%葡萄糖溶液制成菌悬液，制片，光学显微镜(ZEISS 810-10022X)下观察其形状、大小、鞭毛和荚膜等形态特征，参照文献[19-20]对菌株进行形态学鉴定.

1.2.7 菌株ST77的生理生化特征测定 参照文献[19-20]测定菌株ST77的过氧化氢酶、氧化酶、β-半乳糖苷酶、硝酸盐还原、明胶液化、淀粉水解、酪蛋白、精氨酸双水解酶、精氨酸脱羧酶、H2S产生、水杨素、吲哚、溶血和脲酶等生理生化指标.

1.2.8 菌株ST77的分子生物学鉴定 按照上海生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式细菌DNA 提取试剂盒的操作程序提取菌株ST77的16S rDNA.选取细菌16S rDNA通用引物F27 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3′)和P1541(5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCGCA-3′)[11]进行扩增.PCR扩增体系：10×Buffer 2.5 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，dNTPs(2.5 mmol·μL-1)2 μL，上、下游引物(10 pmol·μL-1)各1 μL，补水至25 μL.反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，共30个循环；72 ℃ 10 min.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司测序.

1.2.9 统计与分析 运用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0对数据进行统计与分析，应用Duncan氏新复极差法分析各处理间的差异显著性.

2 结果与分析

2.1 菌株ST77对马铃薯干腐病病原真菌的抑制作用

由表1可知，对峙培养3 d后，中度嗜盐菌ST77对病原真菌青9A-4-13、青9A-5-2和65B-2-6的抑制率分别为27.67%、25.33%和23.67%；对峙培养7 d后，ST77对青9A-4-13的抑制率有所下降，对青9A-5-2的抑制率略有上升，对65B-2-6的抑制率上升最明显，为52.67%；对峙培养14 d后，ST77对3种病原真菌的抑制率均有所上升.由此可见，中度嗜盐菌ST77对病原真菌65B-2-6的抑制活性最高且活性稳定.

表1 中度嗜盐菌ST77对马铃薯干腐病病原真菌的抑制率1)Table 1 The inhibitory rates of moderate halophilic strains ST77 against potato dry rot pathogen

2.2 菌株ST77有机溶剂萃取物对马铃薯干腐病病原真菌的抑制作用

由表2可知，菌株ST77的正丁醇萃取物对3种马铃薯干腐病病原真菌的抑制活性最高，氯仿萃取物的抑菌活性次之，乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最低；3种萃取物对病原真菌的抑制活性基本随着萃取物浓度的升高而增强.其中，正丁醇萃取物对青9A-4-13、青9A-5-2和65B-2-6的最大抑制率分别达58.50%、56.50%和64.50%；氯仿萃取物浓度为20 mg·mL-1时对3种马铃薯干腐病病原真菌的抑制活性最高，抑制率分别达58.00%、40.00%和56.00%；乙酸乙酯萃取物浓度为10和20 mg·mL-1时，对65B-2-6的抑制活性较高，抑制率分别为50.00%和56.00%.由此可见，ST77正丁醇萃取物的抑菌活性最高，且对65B-2-6的抑制活性最高.

表2 中度嗜盐菌ST77萃取物对马铃薯干腐病病原真菌的抑制率1)Table 2 The inhibitory rates of extracts from moderate halophilic strain ST77 against potato dry rot pathogen

表3 中度嗜盐菌ST77对活体马铃薯干腐病 病原真菌的抑制作用1)Table 3 The inhibitory effect of moderate halophilic strain ST77 on potato dry rot pathogen in vivo

2.3 菌株ST77对活体马铃薯干腐病病原真菌的抑制作用

中度嗜盐菌ST77发酵液对65B-2-6的抑制活性最高，抑制率达81.03%；对青9A-5-2的抑制活性次之，抑制率为67.71%；对青9A-4-13的抑制活性最低，坏果率为100.00%，病斑深度达2.11 cm，抑制率为46.53%(表3).

2.4 菌株ST77有机溶剂萃取物对活体马铃薯干腐病病原真菌的抑制作用

由表4和图1可见，接种14 d后，3种有机溶剂萃取物对3种马铃薯干腐病病原真菌具有不同程度的抑制活性.氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物对病原真菌青9A-4-13和65B-2-6具有较高的抑制活性，且抑制率均随着萃取物浓度的升高而增大；而正丁醇萃取物对病原真菌青9A-5-2和65B-2-6具有较高的抑制活性，且抑制率随着萃取物浓度的升高而增大.

2.5 菌株ST77发酵液及其有机溶剂萃取物对马铃薯储藏的安全性

ST77发酵液及其正丁醇萃取物对病原真菌65B-2-6的抑制活性均较高，因此，将马铃薯接种病原真菌65B-2-6后，分别经ST77发酵液及其正丁醇萃取物处理，以进行安全性评价.结果发现，马铃薯表现出一定程度的失重，但创伤处无任何病害症状，病斑深度、病斑宽度及坏果率均为零.这说明中度嗜盐菌ST77发酵液及其正丁醇萃取物对马铃薯储藏安全.

表4 中度嗜盐菌ST77萃取物对活体马铃薯干腐病病原真菌的抑制作用1)Table 4 The inhibitory effect of extracts from moderate halophilic strain ST77 against potato dry rot pathogen in vivo

图1 中度嗜盐菌ST77萃取物对活体马铃薯干腐病的防效Fig.1 The control effect of extracts from moderate halophilic strain ST77 on potato dry rot in vivo

2.6 菌株ST77的鉴定

2.6.1 形态特征 中度嗜盐菌ST77为革兰氏阳性菌，有荚膜，周生鞭毛，细胞形状为细杆状，大小为(0.6～0.8) μm×(0.5～0.6) μm.

2.6.2 生理生化特征 菌株ST77过氧化氢酶、氧化酶、β-半乳糖苷酶、硝酸盐还原、明胶液化、淀粉水解、酪蛋白反应呈阳性，精氨酸双水解酶、精氨酸脱羧酶、H2S产生、水杨素、吲哚、溶血、厌氧和脲酶反应呈阴性，符合芽孢杆菌属(Bacillusspp.)菌株的生理生化特征.

2.6.3 系统发育分析 将扩增所得的ST77的16S rDNA序列提交至GenBank数据库进行序列比对，并获取登录号MW012735.通过Mega 7.0软件包，采用邻接法，构建菌株ST77及与其同源关系较近的其他菌株的16S rDNA系统发育树(图2).由图2可知，菌株ST77与已知菌株Bacilluspumilus(MN238693)聚于同一分支，亲缘关系最近，同源性高达100%.

综合形态特征、生理生化特征及系统发育分析结果，将菌株ST77鉴定为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus).

图2 基于16S rDNA序列构建的菌株ST77及其亲缘关系相近菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenic tree of strain ST77 and its closely related strains based on sequences of 16S rDNA

3 讨论

本研究发现，平皿对峙试验中，中度嗜盐菌ST77发酵液及其萃取物对病原真菌具有不同程度的抑制活性.其中，正丁醇萃取物对病原真菌65B-2-6的抑制活性较高，培养14 d后可形成透明的抑菌圈，这说明芽孢杆菌能够通过代谢途径产生抗菌物质.活体试验结果与平皿对峙试验的结果一致，即ST77正丁醇萃取物对病原真菌65B-2-6的抑制活性最高.此外，中度嗜盐菌ST77发酵液及其正丁醇萃取物对马铃薯储藏安全.经鉴定，中度嗜盐菌ST77为短小芽孢杆菌.有研究显示，短小芽孢杆菌部分种对马铃薯干腐病病原真菌F.culmorum、F.oxysporum和F.sambucinum无明显的抑制活性[21]，与本试验对马铃薯干腐病病原真菌F.acuminatum、F.solani和F.tricinctum的研究结果不同.这可能是由于不同马铃薯干腐病病原真菌存在特异性.今后可以通过正交试验设计对ST77发酵配方及条件进行进一步的优化，使发酵液及其萃取物的活性达到最高；进一步分离及纯化ST77活性次级代谢产物，探明抑制马铃薯干腐病病原真菌的活性组分，进而为其作用机制的研究奠定基础.