健脾复方通过Exo-Wnt3a/5a调控Wnt/β-catenin信号通路抑制大肠癌侵袭转移机制研究

靖 琳，闫国良，楼丹飞，汪海慧

（上海中医药大学附属市中医医院急诊科，上海 200071）

大肠癌为临床上一种常见的恶性肿瘤，临床主要采用手术切除的方式治疗。外泌体（exosomes）在调节细胞功能，肿瘤转移及发展中有重要意义。与正常细胞相比，大肠癌肿瘤细胞会释放更多外泌体，从而在肿瘤侵袭、转移中起到关键作用。外泌体来源的Wnt3a/5a，可对Wnt/β-catenin信号通路产生影响。当Wnt3a/5a信号刺激细胞时，Wnt蛋白会与细胞膜表面受体结合，从而加快癌细胞的转录，提高癌细胞的增殖［1］。本研究对裸鼠人肠癌转移瘤模型进行研究，观察健脾复方对β-catenin、MMP-7、C-MYC、CyclinD1等信号分子的调节，探索健脾复方对大肠癌细胞转移的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

选用60只SPF级雄性健康BALB/c裸鼠，体质量18～20g，4～6周龄，购于上海市中医医院实验动物中心。HCT116/LoVo细胞株来自中科院上海细胞库，Wnt3a/5a、β-catenin抗体、CyclinD1均来自abcam。

1.2 方法

1.2.1 分组

将小鼠随机分为空白对照组（A组）、阳性对照组（B组）、健脾复方低剂量组（C组）、健脾复方中剂量组（D组）、健脾复方高剂量组（E组），每组12只。

1.2.2 模型建立

取对数生长期的HCT116/LoVo细胞株制为1×107/mL的细胞悬液，经台盼蓝染色液测定细胞活性后，取200mL悬液对B、C、D、E组小鼠进行尾静脉注射，待肿瘤生长到100～300mm3，进行后续实验。

1.2.3 健脾复方干预

健脾复方［4］基础方为黄芪30g，炒白术15g，半夏10g，藤梨根30g，淫羊藿15g，薏苡仁30g。使用颗粒中药溶解物（江阴天江药业有限公司）。成人使用健脾复方为1剂130g，相当于颗粒中药13.08g，小鼠灌胃剂量以人临床等效剂量的5～10倍计算，人与小鼠的药物换算系数为12.33，以人的体质量60kg计算，20g小鼠1天所需总生药量T=（13.08g/60kg）×12.33×0.02kg×（10）=1.35g/mL。每日给裸鼠灌胃1次，每次0.4mL。连续给药2周。

1.3 测定指标

治疗结束后，立即处死裸鼠，迅速剥离瘤体进行检测，记录裸鼠肿瘤发生率。

1.3.1 Western Blot检测

检测相关Wnt信号通路蛋白，提取各组瘤体组织总蛋白，测定蛋白浓度，加入上样缓冲液混匀，在进行加热至100℃，冷却后加入PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉进行1h封闭，置于4℃一抗中过夜，于过氧化物酶标记的二抗中孵育1h，使用ECL显色法进行显色，采用Image J对图像进行分析，重复分析3次后得到结果。

1.3.2 流式细胞仪检测

使用无血清培养液进行24h培养，加入缓冲液进行重置，将瘤体细胞密度调节为1～5（106个/mL）。取0.1mL细胞悬液于流式细胞仪试管内，按照标准试剂操作步骤进行检测，重复分析3次后得出结果。

1.4 统计学分析

用SPSS22.0对标本数据进行统计学分析，计数资料以（%）表示、用χ²检验，计量资料以（±s）表示、用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组裸鼠Wnt通路相关蛋白表达比较

A组有1只裸鼠、B组有3只裸鼠、C组有2只裸鼠、D组和E组有3只裸鼠分别死于恶病质，各组中裸鼠瘤体β-catenin、MMP-7、C-MYC、CyclinD1表达的差异均有统计学意义（P＜0.05）。A组表达水平较低，B组表达水平高于A组，C、D、E组蛋白表达逐渐趋于正常，与B组相比，D、E组蛋白表达量低于B组（P＜0.05），如表1所示。

表1 各组裸鼠Wnt通路相关蛋白表达比较 （±s）

表1 各组裸鼠Wnt通路相关蛋白表达比较 （±s）

组别 例 β-catenin MMP-7 C-MYC CyclinD1 A 11 0.81±0.07 0.63±0.18 0.56±0.12 0.42±0.08 B 9 1.55±0.13 1.21±0.15 1.42±0.32 1.11±0.03 C 10 1.27±0.18 1.01±0.19 1.31±0.21 0.98±0.08 D 9 1.02±0.27 0.84±0.16 1.13±0.20 0.72±0.12 E 9 0.84±0.27 0.63±0.29 0.92±0.23 0.56±0.23

2.2 各组裸鼠药物干预后瘤体质量比较

B、C组裸鼠瘤体质量高于其余3组，随着健脾复方剂量上升，D、E组质量均下降，如表2所示。

表2 各组裸鼠干预后瘤体质量比较 （g，±s）

表2 各组裸鼠干预后瘤体质量比较 （g，±s）

组别 成瘤数 瘤体质量A 0 0 1.48±0.18 C 10 1.16±0.22 D 8 0.79±0.17 B 8 0.42±0.14 E 6

2.3 Wnt3a/5a对细胞增殖、侵袭及Wnt/β-catenin信号通路的影响

Western Blot结果表明，观察组细胞内Wnt/β-catenin信号通路的Wnt3a/5a蛋白表达及β-catenin蛋白表达量均低于对照组，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组Wnt3a/5a蛋白相对表达量为（1.01±0.07），观察组（0.52±0.11），（t=14.556，P=0.000）。荧光酶报告表明，Wnt3a/5a结合位点发生突变后，荧光酶活性降低，表明健脾复方可直接抑制癌细胞内Wnt3a/5a表达。流式细胞仪结果显示，观察组细胞侵袭能力低于对照组细胞，转入Wnt3a/5a可降低细胞侵袭能力，差异有统计学意义（P＜0.05）。另转入Wnt3a/5a后，Wnt/β-catenin信号通路下游蛋白表达水平明显降低。见图1、图2。

图1-Wnt3a、Wnt5a蛋白检测电泳图

图2-Western Blot检测Wnt/β-catenin信号通路的蛋白表达

3 讨 论

大肠癌如今首选临床治疗方式为手术切除，但这一般对早期癌症较为有效，对于癌细胞发生转移的患者，临床上主要使用化疗、放疗等方法。中医认为大肠癌是内因与外因共同作用的结果，外在因素包括情志不遂、气滞血瘀等，内在因素包括肾气不足、阴虚湿热等。治疗需调理阴阳、益气补血，提高患者生活质量［3］。

中医本无大肠癌之称，但古代对“癌”却有一定认识，杨士瀛在《遗方论》［4］指出“癌者，毒根深藏，穿孔透里”，内因主要为脾胃功能失调。李东垣《脾胃论》：“元气充足表示脾胃无所伤。”“有瘤体必虚，有虚首健脾”，因此可用健脾解毒中药治疗。健脾复方中白术健脾燥湿，薏苡仁利水渗湿，薏苡仁、白术合用可增强脾功能，增化湿之效。黄芪补肾中元气、健脾益气，藤梨根清热利湿、活血化瘀，淫羊藿补肺、补肾、益精血，半夏燥湿化痰，半夏配藤梨根、淫羊藿等可消肿止痛、化瘀散结［5-6］。诸药合用，有活血化瘀、健脾和胃之效，标本兼治。肿瘤细胞中有基质金属蛋白酶等相关蛋白，可与肿瘤相互作用促进其转移。Wnt/β-catenin信号是细胞分化、迁移、生长的重要调控因子之一，一旦被激活，就能通过Wnt调控进行b-catenin的稳定积累，对细胞增殖、肿瘤细胞发生、发展有重要相关性。而异常激活的Wnt/β-catenin信号会促进细胞增殖，发生改变，促进肿瘤细胞生长，且Wnt3a/5a可促进β-catenin进入细胞核，促进下游蛋白表达，使癌细胞过度激活［7-8］。D、E组裸鼠肿瘤体积低于B、C组，表明健脾复方在癌细胞生长、分化、增殖方面，可显著抑制其增殖、侵袭，促进其凋亡，从而控制大肠癌发展。原因可能是健脾复方中黄芪、党参可刺激肾上腺皮质激素分泌，从而诱导肿瘤细胞凋亡，提高机体抗肿瘤能力［9］。同时，裸鼠Wnt/β-catenin信号受到显著抑制，Wnt3a/5a均少于对照组，表明健脾复方可抑制大肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而抑制癌细胞增殖［10］。除此之外，晚期患者体内免疫功能会出现严重下降，而健脾复方内的党参、黄芪、茯苓等可有效调节体内免疫功能，激活T细胞、NK细胞等免疫细胞活性，清除体内老化细胞、病原体，促进白细胞介素-1、白细胞介素-2等炎性因子产生，从而提高免疫能力［11］。放疗对体内正常细胞也会有一定影响，而健脾复方中黄芪、党参可提高巨噬细胞的吞噬能力，增加化疗效果的作用，减轻不良反应［12］。研究还得出β-catenin、MMP-7、C-MYC、CyclinD1在健脾复方高剂量组中表达水平最低，阳性对照组裸鼠表达高于健脾复方组，即β-catenin异常表达与MMP-7、C-MYC、CyclinD1在大肠癌肿瘤细胞中出现高表达有明显正相关性（P＜0.05）表明健脾复方可下调Wnt/β-catenin信号通路表达，对相关肿瘤因子进行调整，达到改善病症的疗效［13］。Wnt/β-catenin信号通路作为调控大肠癌细胞生长的重要通路之一，β-catenin蛋白对细胞活化十分重要。癌细胞侵袭是指肿瘤细胞向局部侵犯或远处转移，这是恶性肿瘤的重要特征之一，表明健脾复方可有效恢复机体内平衡，避免癌细胞出现转移，从而为肿瘤转移治疗提供新思路。李玉山等［14］指出，Wnt/β-catenin信号通路具有维持正常胃肠道细胞及调控大肠癌癌细胞生长、增殖的作用。因此，Wnt/β-catenin信号通路可作为预防、治疗大肠癌的作用措施，即对其进行调控来降解β-catenin蛋白。王雨艳等［15］检测卵巢癌SKOV-3 细胞增殖、侵袭和凋亡的变化，结果显示Wnt3a可调控β-catenin的表达，抑制细胞周期蛋白合成，从而改善预后。李孝琼等［16］对Wnt3a进行上调，发现β-catenin增加，表明Wnt3a/5a可通过调控Wnt/β-catenin信号通路对癌细胞进行调控。研究通过荧光酶基因实验及Western Blot检测，证明健脾复方可通过Wnt3a/5a有效调控Wnt/β-catenin信号通路，从而对细胞增殖进行控制。

综上所述，健脾复方可通过Wnt3a/5a对Wnt/β-catenin信号通路活化进行调控，从而控制癌细胞的生长及转移。