基于网络药理学研究六君子汤治疗年龄相关性黄斑变性的机制

杨宁，周婕，吴瑞，徐新荣

(南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029)

年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration, AMD)是全球老年人主要不可逆致盲眼病之一，其致盲人数约占全球法定盲的8.7%，全球约有3 000多万AMD患者，每年有50多万人因AMD而致盲[1]。在中国，随着人口的老龄化，AMD所造成的视功能损害人数正逐年增加。

临床上，AMD分为干性和湿性两型，干性AMD至今尚无确切有效的治疗措施，湿性AMD的治疗因抗血管内皮生长因子(VEGF)药物的广泛应用，有效改善和稳定了AMD患者的视力。但抗VEGF药物价格昂贵，又需反复球内注射，这给AMD患者带来心理困扰。有研究报道，六君子汤治疗湿性AMD取得良好效果[2]，但是确切作用机制和靶点并不明确。

网络药理学通过构建靶点-靶点、成分-靶点、成分-靶点-通路等网络来阐明药物的作用机制，非常适合于多成分、多靶点的中药复方作用机制的研究[3]。本研究采用网络药理学方法，探明六君子汤治疗AMD的活性成分、作用靶点和信号通路，并对主要信号通路作用进行验证，以揭示其作用分子机制，阐释其科学内涵，为临床推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 六君子汤由人参9 g，白术12 g，茯苓12 g，炙甘草6 g，陈皮3 g，法半夏5 g组成。药物为颗粒剂，购于江阴天江药业有限公司。

1.1.2 细胞 人视网膜色素上皮细胞ARPE-19，购自美国ATCC公司。

1.1.3 动物 SPF级SD雌性大鼠30只，体质量230～250 g，由南通大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(苏)2019-0001。

1.1.4 主要试剂 t-BHP购于美国Sigma Chemical公司，MTT试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号：G020-1-2)，AKT/p-AKT(4691/4060)、ERK1/2/p-ERK1/2(9102/9101)、p38/p-p38(9212/9211)一抗购自美国Cell Signaling Technology公司，VEGF(sc-7269)、β-actin(sc-47778)一抗和IgG/HRP二抗(sc2030)购自美国Santa Cruz公司。

1.1.5 主要仪器 倒置生物显微镜(德国Leica公司)，酶标仪(美国Synergy公司)，电泳系统(美国Bio-RAD公司)，凝胶成像仪(美国Bio-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 六君子汤活性成分筛选及靶点预测 通过中药网络药理学数据和分析平台(TCMSP)，查询到六君子汤6味中药的化学成分。设定口服生物利用度(OB)≥30%和药物相似性(DL)≥0.18作为筛选条件，筛选出每味中药的可能活性成分，经PubChem数据库确认后，在Swiss Target Prediction数据库查询，设定物种为人，输出前100个靶点，得到该成分的靶点。

1.2.2 AMD相关靶点的收集 以Age-related macular degeneration为检索词，查询DrugBank、TTD和OMIM数据库，检索结果汇集、去重后得到AMD疾病靶点。

1.2.3 活性成分-疾病共同靶点的获取 将筛选得到的可能活性成分靶点和疾病靶点导入Venny 2.1在线平台，获得活性成分与疾病的共同靶点。

1.2.4 蛋白-蛋白相互作用网络、活性成分-靶点网络的构建 将共同靶点导入String 11.0数据库，设定物种为人、置信度为0.700，获取蛋白相互作用信息；采用Cytoscape 3.8.0软件，构建蛋白-蛋白相互作用网络及活性成分-靶点网络。

1.2.5 靶点功能通路富集分析 将共同靶点导入David 6.8数据库，设定物种为人，进行GO功能和KEGG通路富集分析，结果用R语言软件进行可视化处理。

1.2.6 含药血清制备 SD大鼠随机分为空白对照组和六君子汤组，每组15只。依据“人和动物体表面积折算的等效剂量比值”计算出六君子汤大鼠给药的等效剂量为0.296 g/kg，生理盐水溶解后(2 mL)给大鼠灌服，空白对照组灌服等量生理盐水，每日1次，连续7 d。末次给药后1 h股动脉采血，采血后室温静置2～4 h，4 ℃离心15 min后取上清液，然后56 ℃水浴灭活，超净台过滤除菌后制得含药血清，血清分装成几管，每管1 mL，-20 ℃保存备用。

1.2.7 六君子汤对ARPE-19细胞活性的影响 取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，细胞长满80%时，先加入空白血清和2.5%、5%、10%含药血清常规培养24 h，后加入10 μL的0.5% MTT溶液，继续孵育4 h。吸出孔内培养液，每孔加入DMSO终止反应，酶标仪在490 nm波长处测定各孔吸光度(OD值)，计算细胞存活率。

1.2.8 六君子汤对氧化损伤ARPE-19细胞活性的影响 细胞分为空白对照组、溶媒对照组、含药血清组(分2.5%、5%、10% 3个剂量组)。取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，细胞长满80%时，先加入溶媒(空白血清)和2.5%、5%、10%含药血清常规培养24 h，后加入浓度为200 μmol/L的氧化诱导剂叔丁基过氧化氢(t-BHP)溶液常规培养24 h，空白对照组不加含药血清和t-BHP。各组细胞按方法“1.2.7”项下测定各孔吸光度(OD值)，计算细胞存活率。

1.2.9 Western blot 按“1.2.7”方法进行细胞铺板和培养，细胞裂解后提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。变性后取50 μg上样，用100 g/L分离胶、50 g/L浓缩胶电泳，之后转到硝酸纤维素膜上。加一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜后加兔二抗(1∶5 000)，β-actin为内参，加入化学发光剂显影，Image J软件进行图像分析。

2 结果

2.1 六君子汤的化学成分、活性成分及靶点

通过TCMSP平台以及Swiss Target Prediction数据库查询得到的六君子汤化学成分、活性成分及靶点数见表1。

2.2 AMD疾病靶点

查询DrugBank、TTD和OMIM数据库，分别得到232、12和37个靶点，去重后获得AMD疾病靶点266个。

2.3 活性成分-疾病共同靶点

将活性成分靶点934个和疾病靶点266个进行Venny分析，得到共同靶点92个。见图1。

图1 六君子汤活性成分和AMD靶点韦恩图

2.4 共同靶点相互作用网络

将共同靶点导入String 11.0数据库，获取蛋白相互作用信息，经Cytoscape 3.8.0软件可视化分析，结果见图2。网络由88个节点和506条边构成。节点表示靶蛋白，用于显示节点的重要性，节点越大、颜色越深，表明度值越大；每条边则表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系，线条越多表示关联度越大。靶蛋白平均节点度值为11.5，超过平均度值的靶蛋白有37个：MAPK3、MAPK1、AKT1、VEGFA、MAPK8、RAC1、NFKB1、MAPK14、PRKCD、PRKCB、APP、HDAC1、RELA、PRKCA、HDAC3、MAPK9、LYN、HDAC6、MAPK11、HDAC2、PRKCQ、PTK2、MAPK10、PRKCZ、PTK2B、HDAC5、PRKCE、KDR、HDAC10、HDAC4、IKBKB、PRKCG、MAPK13、MCL1、AKT2、EPHB2、NTRK1，这些蛋白可能是六君子汤治疗AMD的关键靶点。

图2 六君子汤与AMD共同靶点蛋白作用网络图

2.5 活性成分-靶点网络

将共同靶点及活性成分数据导入Cytoscape 3.8.0软件进行可视化分析，结果见图3。网络由189个节点和798条边构成。绿色节点代表活性成分，橙色节点代表靶点，边代表活性成分和靶点之间的相互关系。活性成分网络平均节点度值为8.443，超过平均度值的活性成分有39个，其中甘草26个，人参11个，茯苓2个，半夏1个，陈皮1个。结果见表2。这些化合物可能是六君子汤治疗AMD的主要活性成分。

表2 六君子汤治疗AMD的主要活性成分

2.6 靶点GO功能和KEGG通路富集分析

GO分析得到417个条目，其中生物过程277个，将排名前20的生物过程条目进行可视化分析，结果见图4。由图可见，生物过程主要富集在转录因子结合、丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白质磷酸化、蛋白激酶C活性、蛋白激酶活性、蛋白脱乙酰酶活性、蛋白自磷酸化、肽-丝氨酸磷酸化、NAD依赖的组蛋白脱乙酰酶活性、MAP激酶活性等。提示六君子汤通过多种生物途径发挥治疗作用。

图3 六君子汤活性成分-靶点网络图

图4 共同靶点的GO功能的生物过程富集图

KEGG通路分析产生107个条目，可视化分析结果见图5。由图可见，共同靶点主要富集在VEGF信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、神经鞘脂质信号通路、NOD样受体信号通路、催乳素信号通路、神经营养素信号通路、MAPK信号通路、炎症介质对TRP通道的调节、Fc epsilon RI信号通路，提示六君子汤治疗AMD可能与影响这些信号通路有关。

图5 共同靶点的KEGG富集图

2.7 六君子汤对ARPE-19细胞活性影响

检测结果见图6。由图可知，空白血清及3个浓度六君子汤含药血清对细胞存活率没有明显影响。

图6 不同浓度六君子汤对ARPE-19细胞活性的影响

2.8 六君子汤对氧化损伤ARPE-19细胞活性的影响

检测结果见图7。由图可知，与空白对照组比，溶媒对照组细胞存活率显著降低(P<0.01)；与溶媒对照组比，含药血清组细胞存活率显著增加(P<0.05，P<0.01)，呈浓度依赖性。

注：与空白对照组比较，**P<0.01；与溶媒对照组比较，

2.9 Western blot实验

各组细胞VEGF、AKT/p-AKT、ERK1/2/p-ERK1/2、p38/p-p38蛋白表达检测及分析结果见图8。与空白对照组比，溶媒对照组各蛋白表达水平显著上调(P<0.01)；与溶媒对照组比，含药血清组各蛋白表达水平明显下调(P<0.05，P<0.01)，均呈浓度依赖性。

3 讨论

六君子汤出自明代医籍《医学正传》，由人参、白术、茯苓、甘草、陈皮、半夏6味中药组成，有益气健脾、燥湿化痰功效。临床主要用于治疗慢性胃肠功能紊乱、消化道溃疡、慢性阻塞性肺炎、心脑血管疾病、帕金森病等。眼科主要用于湿性AMD和糖尿病性视网膜病变的治疗[4-5]。

AMD的发病机制尚不十分清楚。目前普遍认为，各种致病因素导致的视网膜色素上皮细胞(RPE)功能损伤是AMD发病的关键。RPE细胞为光感受器提供结构支撑和功能维护、维持血-视网膜屏障完整、参与视色素的代谢、吞噬和降解光感受器脱落的膜盘、表达分泌多种生长因子。RPE细胞功能受损，导致Bruch膜老化、玻璃疣形成，影响视网膜营养代谢，使外层视网膜缺氧，这是脉络膜新生血管形成(CNV)的关键驱动因素[6]。氧化应激和炎症反应，也可通过多种途径刺激RPE产生过量VEGF，诱导CNV形成，最终导致AMD患者视功能严重损害。

基于中药多组分、多靶点、多途径的作用特点，本研究采用网络药理学方法，以探明六君子汤治疗AMD的机制。活性成分-靶点网络分析获得主要活性成分39个，其中甘草26个、人参11个、茯苓2个、半夏1个、陈皮1个，提示甘草、人参是六君子汤治疗AMD的主药。活性成分有多种生物作用：啤酒甾醇(Cerevisterin)通过调控MAPK、NF-κB、AP-1和Nrf2/HO-1信号通路，对炎症性疾病起治疗作用[7]；甘草查尔酮A (Licochalcone A)可激活Nrf2通路和自噬，对LPS/Galn诱导的肝毒性具有保护作用[8]；五味子酯B(Gomisin B)通过上调PI3K/AKT/mTOR通路，增加GLT-1水平，起到抗抑郁作用[9]；山柰酚(Kaempferol)通过多个信号通路发挥抗退行性疾病、抗氧化、抗炎、抗癌、抗糖尿病等作用[10]；吉九里香碱(Girinimbine)通过PI3K/AKT、mTOR和Wnt/β-Catenin信号通路抑制人卵巢癌细胞的体外增殖[11]；山柰酚、槲皮素(Quercetin)和柚皮素(Naringenin)则有防治AMD的潜力[12-14]。蛋白相互作用网络分析得到37个关键靶点，对这些靶点进行GO功能分析，主要富集在转录因子结合、丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白质磷酸化、蛋白激酶C活性、蛋白激酶活性、蛋白脱乙酰酶活性、蛋白自磷酸化、肽-丝氨酸磷酸化、NAD依赖的组蛋白脱乙酰酶活性、MAP激酶活性等生物过程；KEGG通路分析显示主要富集于VEGF信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、神经鞘脂质信号通路、NOD样受体信号通路、催乳素信号通路、神经营养素信号通路、MAPK信号通路、炎症介质对TRP通道的调节、Fc epsilon RI信号通路等。VEGF信号通路是CNV形成的关键途径，Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路均与AMD发病密切相关[15-18]，这些通路影响细胞增殖和迁移、血管形成、细胞凋亡、炎症过程。基于VEGF信号通路是CNV形成的关键通路，又是六君子汤和AMD共同靶点KEGG富集最高的通路，本研究采用ARPE-19细胞进行了验证。结果显示，六君子汤能提高氧化损伤细胞的存活率；进一步观察发现，六君子汤可下调VEGF通路相关蛋白VEGF、AKT、ERK1/2 (MAPK3、MAPK1)、p38(MAPK14)表达水平，提示六君子汤可能通过抑制VEGF通路，对CNV形成起到抑制作用，这解释了临床上六君子汤治疗湿性AMD效果确切的原因[2,4]。需要指出的是，AMD是一种多因素疾病，发病机制涉及多条信号通路，VEGF通路只是其中之一。本研究结果也提示，六君子汤对多条AMD相关信号通路有影响。因此，要阐明六君子汤治疗AMD的机制，尚需进行更多深入研究。

综上所述，本研究采用网络药理学方法，对六君子汤治疗AMD可能活性成分、作用靶点、信号通路及作用机制做了初步探讨。研究结果显示，六君子汤的活性成分主要通过VEGF信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路，影响细胞增殖和迁移、血管形成、细胞凋亡和炎症过程，发挥防治AMD的作用；通过氧化损伤ARPE-19细胞，初步验证六君子汤能抑制VEGF信号通路，从而起到抑制CNV形成的作用。本研究存在一定的局限性，研究仅基于数据分析，但无论是中药成分及靶点、疾病靶点，不同数据库间的数据差异比较大。另外，研究结果尚需进行更多体内、外验证，以期为六君子汤在AMD防治的推广应用提供依据。