三色散凝胶贴膏剂的HPLC指纹图谱研究和多元成分含量测定

杨楠,刘子修，茆军，张力，廖太阳，王培民，张农山

(南京中医药大学附属医院/江苏省中医院，江苏 南京 210029)

“易层”贴敷是本研究团队在上海石氏伤科经验方的基础上，以温经活血立法研发的临床外治敷贴，后经著名中医骨伤科专家诸方受教授传承发扬，自20世纪50年代沿用至今[1]。三色散是“易层”贴敷的核心组方之一，由炒蔓荆子、丹参、白芷、羌活、川牛膝、防风、制马钱子、秦艽、甘草等20味中药材组成，具有温经通络、散寒除湿、蠲痹止痛等功效，临床上配合寒性组方三黄油膏“易层”使用，辨证治疗膝骨关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)疗效显著[2-3]。大量临床实践表明，三色散可以有效改善膝骨关节炎疼痛、肿胀、关节功能障碍等临床症状[3]，对急慢性软组织损伤及足跟痛亦有良好的治疗效果[4-5]。基础研究发现，三色散可以靶向瞬时电位离子通道，干预KOA外周痛敏环节，阻断温度、压力伤害感受器对痛觉信号的传导，显著增加KOA模型动物的冷痛阈值和机械痛阈值[6]；还可抑制NLRP3炎症通路，缓解KOA关节僵硬,改善关节功能等[7]。因此，无论从临床应用还是基础研究方面都证明了三色散是一种有效治疗膝骨关节炎的处方，具有深入研究的意义和价值。

目前，三色散在临床使用中仍遵循“饴糖调糊-手工滩涂-包扎固定”的中药贴敷传统用法，使用时需要临时调配，不能长期储存，限制了其推广使用。此外，中药凝胶贴膏作为近年来广泛流行的新型外用剂型，与传统剂型相比，具有载药量大、皮肤刺激性小、依从性高的突出优势，作为三色散的改进剂型十分合适[8]。三色散中药味繁多，成分复杂，为了全面反映其内在质量，中药指纹图谱是一种国际公认的对中药材及中药制剂进行整体性评价的有效方法，满足对三色散质量控制的诉求。

本研究拟建立三色散凝胶贴膏剂的HPLC指纹图谱，并对其多种成分进行含量测定，为更好地控制三色散凝胶贴膏剂的质量及临床开发提供科学的依据。

1 材料

1.1 仪器

Alliance 2695e型高效液相色谱仪(Empower工作站，2998二极管阵列检测器，四元梯度混元泵，美国Waters公司)，CAP1003S型千分之一及CAP224D型十万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，KQ-1000型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，22331型高速台式离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 试剂

对照品蔓荆子黄素(批号：111554)、丹参酮ⅡA(批号：110766)、欧前胡素(批号：110826)、异欧前胡素(批号：110827)、甘草苷(批号：111610)均购自中国食品药品检定研究院；紫花前胡苷(批号：PCS-200309)、羌活醇(批号：PCS-200309)均购自成都植标化纯生物技术有限公司；杯苋甾酮(批号：6610)、升麻素苷(批号：8617)均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；士的宁(批号：DSTDS002602)、马钱苷酸(批号：DSTDM003301)均购自成都德思特生物技术有限公司；甘草酸(批号：MUST-20042407)购自成都曼思特生物科技有限公司，以上所有对照品的质量分数均>98%。甲醇、乙腈为色谱纯(美国Merck公司)，磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

1.3 药物

三色散(苏药制字：Z040000566)购自南京中医药大学附属医院制剂部。三色散凝胶贴膏剂及空白基质贴膏剂均为实验室自制，每剂三色散凝胶贴膏剂含生药1.0 g，空白基质贴膏剂不含三色散。10批三色散凝胶贴膏剂的批号分别为20210119，20210123，20210125，20210131，20210201，20210301，20210305，20210310，20210311，20191130，编号分别为S1～S10。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Hypersil Gold C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱程序见表1，流速为：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：240 nm；进样量：20 μL。在此条件下，各成分色谱峰的分离度良好，混合对照品溶液的HPLC色谱图见图1，三色散凝胶贴膏剂供试品溶液的HPLC色谱图见图2。

表1 梯度洗脱程序

1.马钱苷酸；2.士的宁；4.升麻素苷；6.甘草苷；7.紫花前胡苷；8.杯苋甾酮；9.蔓荆子黄素；10.甘草酸；11.欧前胡素；12.羌活醇；13.异欧前胡素；16.丹参酮ⅡA；λ=240 nm

1.马钱苷酸；2.士的宁；4.升麻素苷；6.甘草苷；7.紫花前胡苷；

2.2 三色散凝胶贴膏剂的制备

将处方量的聚丙烯酸钠、甘羟铝、薄荷脑、樟脑混合均匀后加入甘油搅拌均匀，为油相；将处方量的酒石酸、超纯水、卡波姆、三色散粉末搅拌均匀，为水相；将水相加到油相中，真空搅拌成型后，将膏体均匀涂布于无纺布上，加盖压花膜，室温放置12 h，即得三色散凝胶贴膏剂。

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备 精密称取马钱苷酸、士的宁、升麻素苷、甘草苷、紫花前胡苷、杯苋甾酮、蔓荆子黄素、甘草酸、欧前胡素、羌活醇、异欧前胡素、丹参酮ⅡA的对照品适量，加甲醇配成质量浓度分别为1.040、1.006、1.012、1.040、1.080、1.054、1.042、1.060、1.044、1.024、0.900、1.066 mg/mL的对照品储备液。取各对照品储备液适量,置于同一量瓶中，加甲醇定容至刻度，按比例稀释，即得不同浓度的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取三色散凝胶贴膏剂，除去盖衬，剪碎，称取8.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇20 mL，称定质量，超声处理30 min，冷却至室温，再次称定质量，用70%甲醇补足损失的质量，吸取适量溶液至离心管中，12 000 r/min离心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 空白基质溶液的制备 取空白基质贴膏剂，按照“2.3.2”项方法制备空白基质溶液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 取空白基质溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.1”项色谱条件进样20 μL检测，结果表明空白基质对所测组分无干扰。结果见图3。

图3 空白基质溶液的HPLC色谱图

2.4.2 精密度试验 取三色散凝胶贴膏剂(批号：20210131)，按“2.3.2”项制备供试品溶液，连续进样6次，以7号峰紫花前胡苷为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对峰面积RSD<4.7%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取三色散凝胶贴膏剂(批号：20210131)6份，按“2.3.2”项平行制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行检测，以7号峰紫花前胡苷为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对峰面积RSD<3.6%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取三色散凝胶贴膏剂(批号：20210131)，按“2.3.2”项制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48 h进行测定，以7号峰紫花前胡苷为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积。结果显示，各共有峰的相对峰面积RSD<4.6%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱建立与相似度分析

取10批三色散凝胶贴膏剂，按“2.3.2”项制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行分析测定。将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A版进行分析，与混合对照品比对指认了12个共有峰，生成10批三色散凝胶贴膏剂的HPLC指纹图谱和对照指纹图谱，结果见图4。色谱峰中7号峰紫花前胡苷的峰面积及分离度较好，且紫花前胡苷为羌活的主要成分之一，因此将其作为参照峰。计算各共有峰的相对峰面积，并进行相似度评价，结果显示10批三色散凝胶贴膏剂的相似度在0.943～0.994之间，表明这10批三色散凝胶贴膏剂的化学成分一致性较好，结果见表2。

图4 10批三色散凝胶贴膏剂的指纹图谱

表2 10批三色散凝胶贴膏剂的相似度

2.6 含量测定

2.6.1 色谱条件和样品制备 色谱条件同“2.1”项；三色散凝胶贴膏剂的制备同“2.2”项；溶液的制备同“2.3”项。

2.6.2 线性关系的考察 分别精密吸取不同浓度的混合对照品溶液适量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.1”项的条件进样检测。分别以各对照品的浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程，结果见表3，表明各成分在相应浓度范围内线性关系良好。

表3 各成分的线性方程及其浓度范围

2.6.3 方法学考察

2.6.3.1 精密度、重复性、稳定性试验 精密吸取混合对照品溶液20 μL，连续进样6次，计算12个成分峰面积的RSD值；称取三色散凝胶贴膏剂(批号：20210131)6份，分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件测定，计算12个成分含量的RSD值；精密吸取上述供试品溶液，在第0、4、8、12、24、48 h进样，计算12个成分峰面积的RSD值，结果见表4。

2.6.3.2 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批三色散凝胶贴膏剂6份，每份4.0 g，按照1∶1的比例将12个成分的对照品加入到样品中，按照“2.3.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下条件测定，计算加样回收率，结果见表4。

表4 12个成分的方法学考察结果(%)

2.6.4 样品含量测定 取10批三色散凝胶贴膏剂，分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件测定,计算12个成分的含量。结果见表5。

表5 10批三色散凝胶贴膏剂含量测定结果(mg·g-1)

3 讨论

本实验在制备供试品溶液时考察了提取溶剂(甲醇和乙腈)、提取溶剂的浓度(30%、50%、70%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30)和超声时间(15、30、60 min)[9]，通过比较各成分分离度及峰面积，70%甲醇提取效果理想，料液比为1∶20时提取较为完全，超声30 min较15 min峰面积增加明显，超声30 min与60 min相差不大。综合各因素选择70%甲醇20 mL超声30 min提取样品，获取的色谱信息最多。

测定波长的选择对分析的准确度和灵敏度均有影响，通常选择最大吸收波长测定，可减小误差，提高检测准确性。本实验取供试品溶液20 μL，采用紫外PDA检测器进行全波长(190～400 nm)扫描，获取并分析色谱图，比较了不同波长下色谱峰的数目、各成分分离情况、峰面积大小，发现240 nm处色谱峰最多，分离度和峰面积最大，故选择240 nm作为检测波长[10]。进一步考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相，使用甲醇-水、乙腈-水洗脱时，乙腈较甲醇洗脱能力强，分离情况较好，但士的宁、甘草酸等部分色谱峰峰形不佳，在加入磷酸水溶液后，色谱图基线平稳、峰形有所改善，因此选择乙腈-0.1%磷酸水溶液作为检测的流动相。

指纹图谱是国际公认的对中药材和中药制剂质量控制的重要评价方法，能够较为全面地反映各种物质的化学信息和特征[11-13]。本实验选取了君药炒蔓荆子，臣药丹参、白芷、羌活、川牛膝、防风、制马钱子、秦艽及甘草等主要药材进行研究，建立了三色散凝胶贴膏剂的HPLC指纹图谱，测定了其中的12个成分，具有一定的代表性。目前该制剂仅在本实验室内制作，存在各批次制作时间相近，色谱分析时间过长等不足，因此后续我们将继续优化制备工艺，并进一步考察其药效学研究和安全性评价等项目，完善三色散凝胶贴膏剂的质量控制体系，保证产品的安全性和稳定性。

本实验建立了三色散凝胶贴膏剂的HPLC指纹图谱及多种活性成分含量的测定方法，较好地反映了三色散凝胶贴膏剂的内在质量，可作为三色散凝胶贴膏剂的质量评价方法，为开发质量稳定可控的新型三色散外用制剂、扩大临床应用奠定了基础。