大厂茶茶叶中游离氨基酸及挥发性芳香物质分析

刘苇，邓朝义，陈兴，卢永成，廖德胜

（1. 贵州黔西南喀斯特区域发展研究院，贵州 兴义 562400；2.普安县鸡洞古茶农民专业合作社，贵州 普安 561500）

大厂茶Camellia tachangensis为山茶科Theaceae山茶属Camellia茶组Sect.Thea植物[1-7]，是茶组植物中较原始的种之一，在系统进化上处于较原始的位置，对研究茶树的起源、演化等具有重要价值。大厂茶是特产于滇、黔、桂交界地区的国家优质重点保护茶，也是黔西南州地方特色茶“普安红”的加工原料。茶叶的品质受茶树鲜叶中茶多酚类、氨基酸类、生物碱类、茶多糖类、色素类及香气物质等内含物的影响[8-13]。氨基酸是形成茶叶滋味的重要组成部分，对茶汤中鲜、甜滋味有协调作用[14]。茶叶中的氨基酸分为游离态氨基酸、结合态氨基酸，在水浸出物中呈游离状态存在的具有α-氨基的有机酸统称为游离氨基酸（Free amino acid,FAA）[15]，它是茶叶中重要的鲜爽味呈味物质[16]，也是评价茶叶鲜爽度的一个重要指标，在制茶过程中还可转变为香气物质。茶叶香气物质即挥发性芳香物质（Volatile aromatic compounds,VAC）在茶叶中的含量低，但由于其感官阈值低[17]，对茶叶的风味形成和品质都具有重要作用，在各类茶的审评因子中香气的评分系数占比达25%～35%[18]。茶叶香气形成的基本因素和途径是前体物质的生物合成，而前体物质的含量、种类及酶活性取决于茶鲜叶内含物[19-20]。茶叶中的VAC组分主要包括碳氢化合物、醇类、酮类、醛类、酯类、酸类、内酯类、含氮和杂氧化合物等[21-23]。

目前，对不同产地、不同种类、不同品种的茶鲜叶及成茶产品的FAA、VAC组分含量、差异比较等研究[24-45]较多也较深入，对大厂茶的主要常规生化成分（茶多酚、儿茶素、生物碱、氨基酸等）以及大厂茶与山茶属茶组其他种之间生化成分的差异也有一些研究报道[46-51]，但是对大厂茶的生化成分多样性、游离氨基酸、香气等都还鲜有研究报道。本研究通过对黔西南州8株大厂茶野生茶资源的FAA和VAC进行分析，以期为优良品系选育和优质成茶加工原料筛选提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取贵州省普安县青山镇哈马村和安龙县海子镇马赤黑村的8株野生大厂茶为研究材料，植株均长势良好，成叶深绿色、革质，芽叶无毛、肥壮、油亮，加工过程中胶质明显，其具体情况见表1。

表1 8株大厂茶的生物学性状Table 1 Growth traits of 8 individuals of C.tachangensis

1.2 方法

1.2.1 材料 参照《农作物种质资源鉴定技术规程 茶树》（NY/T1312—2007）[52]的方法，于2020年5月4日按一芽二三叶的标准采样，于40℃低温烘干，待测。

1.2.2 检测 茶叶中的FAA采用全自动氨基酸分析仪法、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）进行检测[30,53]，色谱柱为Phenomenex Gemini C18液相色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流动相A：25 mmol·L-1醋酸钠缓冲液:四氢呋喃=95∶5（V∶V），pH 5.8；流动相B：甲醇；荧光检测：Em340 nm，Ex450 nm；柱温32℃；流速1 mL·min-1；进样量5 μL。

茶叶中的VAC采用顶空-固相微萃取-气质联用仪法（HS-SPME-GC-MS）进行测定[20]，在60℃的平板加热条件下顶空萃取60 min后，移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口（温度250℃）中，热解析3 min进样。色谱柱为HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，初始温度40℃（保留2 min），以3.5℃·min-1升温至208℃，再以10℃·min-1升温至308℃，运行时间为55 min；汽化室温度为250℃。

色谱柱柱温的计算公式如下：

式中，T1为介于40～208℃的柱温；T0为初始温度40℃；t1为柱温40～208℃时某个芳香物质挥发出来的保留时间；t0为初始保留时间（2 min）；Z1为40～208℃时的升温速度3.5℃·min-1；

式中，T2为介于208～308℃的柱温；T0'为初始温度208℃；t2为柱温208～308℃时某个芳香物质挥发出来的保留时间；t0'为柱温为208℃时的保留时间；Z2为柱温为208～308℃时的升温速度10℃·min-1。

1.2.3 数据统计分析 采用Excel 2007进行数据整理，采用SPSS 19.0进行数据统计参数分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 FAA的结果与分析

2.1.1 大厂茶茶叶中FAA的差异性分析 由表2可知，在8株大厂茶茶叶中的FAA组分除了在Q7的茶叶中检测到24种（未检测到色氨酸）、在Q8的茶叶中检测到23种（未检测到尿素、色氨酸），在其余6株的茶叶均检测到25种；25种FAA组分之间含量相差较大。25种FAA组分的含量均值在0.048～3.276 mg·g-1，其中，以茶氨酸的含量最高，为0.671～7.138 mg·g-1，在FAA总量中的占比也最高，为6.228%～37.037%；其次是亮氨酸，其含量为0.777～1.707 mg·g-1，在总量中的占比为7.493%～11.523%；甘氨酸的含量最低，为0.045～0.053 mg·g-1，仅占总量的0.257%～0.468%。在检测到的7种必需氨基酸（赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸）中，除了亮氨酸的含量均值大于1 mg·g-1，其余6种的含量都小于1 mg·g-1，色氨酸为第一限制氨基酸。

由表2还可以看出，25种FAA组分含量及总量的变异系数差异也较大（11.513%～64.536%），其中甘氨酸的变异系数最低（11.513%），色氨酸的变异系数最高（64.536%）。在8株大厂茶茶叶中，除了6株样树之间（Q5、Q6、Q4、Q1、Q7、Q3之间，以及Q4、Q1、Q7、Q3、Q8、Q2之间）的甘氨酸差异不显著；5株样树之间（Q5、Q4、Q8、Q7、Q1之间，Q4、Q8、Q7、Q1、Q3之间，以及Q8、Q7、Q1、Q3、Q2之间）的脯氨酸差异不显著；5株样树之间（Q5、Q3、Q2、Q7、Q6之间）的丙氨酸差异不显著；5株样树之间（Q6、Q4、Q2、Q1、Q3之间）的胱氨酸差异不显著；5株样树之间（Q3、Q1、Q5、Q7、Q6之间）的赖氨酸差异不显著；4株样树之间（Q1、Q2、Q3、Q4之间）的磷乙醇胺差异不显著，4株样树之间（Q5、Q6、Q3、Q4之间）的尿素差异不显著，前述7种FAA组分在剩余样树间的差异，以及其余18种FAA组分和FAA总量在8株大厂茶之间的差异都达到了显著水平（P＜0.05），说明8株大厂茶样树茶叶中的FAA多样性较丰富。

从表2中可知，在8株大厂茶茶叶中，呈鲜甜味[29,54-55]的FAA组分有天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、茶氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、β丙氨酸、γ氨基丁酸12种，其含量均在5.913～13.529 mg·g-1，在总量中的占比为56.853%～71.872%，其中，呈鲜味[29,54-55]的有天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、茶氨酸4种，其含量在2.194～8.731 mg·g-1，在FAA总量中的占比在20.840%～45.300%；呈苦味[29,54-55]的FAA组分除Q7、Q8有8种（不含色氨酸）外，其余6株都有缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸、鸟氨、赖氨酸、精氨酸9种，其含量在3.768～5.754 mg·g-1，在总量中的占比在26.836%～39.661%。以上结果说明，在8株大厂茶茶叶的25种FAA组分中，以呈鲜甜味的组分占绝对优势，这可能是茶汤中鲜爽味及甜味的重要来源。

表2 8株大厂茶茶叶中FAA组分的基本统计参数Table 2 Component of FAA in 8 individuals of C.tachangensis

2.1.2 不同种类FAA主成分分析 以大厂茶茶叶中25种FAA组分含量为基础，计算各主成分的因子载荷和贡献率，结果见表3。由表3可知，前4个主成分（PC1、PC2、PC3、PC4）的贡献率分别为36.956%、23.889%、16.615%和10.356%，其累积贡献率为87.825%，所以利用前4个主成分即可代表被考查性状的原始数据信息。其中，PC1的决定因子有13个（尿素、天冬氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、β丙氨酸、γ氨基丁酸、鸟氨酸、赖氨酸），PC2的决定因子有6个（磷乙醇胺、苏氨酸、茶氨酸、缬氨酸、胱氨酸、色氨酸），PC3的决定因子有3个（谷氨酸、甘氨酸、精氨酸），PC4的决定因子有3个（磷酸丝氨酸、脯氨酸、组氨酸）。而前4个主成分的决定因子总数为25个，与8株大厂茶样树茶叶检出的FAA组分数量相等，这说明全部（25种）FAA组分才能反映出大厂茶茶叶FAA的特性。

表3 各FAA组分主成分的因子载荷和贡献率Table 3 Factor loading and contribution rate of FAA component

2.2 VAC的结果与分析

2.2.1 大厂茶茶叶中VAC的总体情况分析 根据公式（1）得出，保留时间50 min时色谱柱的柱温达到208℃；由公式（2）得出保留时间60 min时色谱柱的柱温达到308℃。从VAC总离子流TIC图（图1）可以看出，在8株大厂茶茶叶中的大部分VAC的保留时间在4～45 min，所以对应的色谱柱的柱温都应按公式（1）计算。出峰时间基本都在4～8、10～15、17～25、27～29、35～36、39～40 min，最大峰值出现在24 min左右。可见在8株大厂茶茶叶中，随着色谱柱柱温的升高，挥发出的VAC的量逐渐增多，到117℃左右（保留时间24 min左右）达到最大值，随后下降，在169.5～173℃（保留时间为39～40 min）时出现最后一次小的峰值后，挥发出的VAC逐渐趋近0，说明在8株大厂茶茶叶中低沸点（200℃以下）的VAC含量占了绝大部分。

图1 8株大厂茶茶叶中VAC的总离子流TIC图Figure 1 Total ion chromatogram of VAC in 8 individual of C.tachangensis

2.2.2 VAC组分分析 由表4可知，从8株大厂茶的茶叶中共鉴定出VAC组分10类104种，其中醇类有28种、醛类有25种、酮类有16种、烷烃类有11种、烯烃类有9种、酯类有6种、酸类有3种、含氮化合物有3种、杂氧化合物有2种、含硫化合物仅1种。在10类化合物中（表5），醇类物质的含量占绝对优势，为52.350%～74.765%，其次是醛类物质，含量为10.425%～26.604%，表明大厂茶茶叶中的VAC是以醇类、醛类为基础的。

从表5可以看出，在8株大厂茶的茶叶中都含有10类化合物，VAC组分的种类也较丰富，其中以Q5的VAC组分种类最多（94种），其次是Q1和Q2的（88种），Q6的最少（79种），说明8株大厂茶茶叶中的VAC组成存在一定差异。在8个样株的茶叶中，每类化合物包含的VAC组分种类也存在一定的差异，在Q1中以烷烃类化合物的种类最多（11种），在Q4中以杂氧化合物的种类最多（2种），在Q5中以醇类、醛类、酮类、含氮化合物的种类最多（分别为28、23、14、3种），在Q6中以酯类化合物的种类最多（6种）；在Q4中以醛类化合物的种类最少（20种），在Q6中以醇类、酮类、烷烃类、烯烃类化合物的种类最少（分别为23、9、8、5种），在Q8中以酯类化合物的种类最少（4种）。在每个样株的茶叶中，VAC组分含量占提取物总量百分比也存在一定的差异，以Q3的VAC组分含量占提取物总量百分比最高（97.348%），Q5的次之（97.242%），Q6的最低（95.794%）。

在8株大厂茶的茶叶中，平均含量大于1%的主要呈香物质[22-23]包括15种（表4），其中醇类有7种、醛类有5种、酮类有2种、酯类仅1种，包括（Z）-3-己烯醇（青叶醇）、芳樟醇及其氧化物、苯乙醇、己醛、（E）-2-己烯醛、苯甲醛、（E,E）-2,4-庚二烯醛、壬醛、（E,E）-3,5-辛二烯-2-酮、反式β-紫罗兰酮、水杨酸甲酯。8株大厂茶茶叶中的主要呈香物质的平均含量为76.688%，其中以Q5中的含量为最高（79.488%），Q8中的次之（79.284%），Q1中的最低（70.808）。从8株大厂茶茶叶中主要呈香物质的种类看，除Q5只含14种（不含壬醛）外，其余7株均含15种。但从15种主要呈香物质在每个样株中的贡献率看，反式β-紫罗兰酮在Q1、Q5、Q7、Q8中的含量均小于1%，不作为这4株的主要呈香物质；（E,E）-2,4-庚二烯醛在Q2、Q5、Q7、Q8中的含量小于1%，不作为这4株的主要呈香物质；Q5中苯甲醛的含量小于1%、壬醛未检出，这2个组分也不作为Q5的主要呈香物质。因此，Q3、Q4、Q6的实际主要呈香物质为15种，Q1、Q2的实际主要呈香物质为14种，Q7、Q8的实际主要呈香物质为12种，Q5的实际主要呈香物质仅11种。

表4 8株大厂茶茶叶中挥发性芳香物质组分及相对含量Table 4 Component and content of VAC in 8 individuals of C.tachangensis

表4（续）

表4（续）

表4（续）

表5 8株大厂茶茶叶中挥发性芳香物质的组分分类及含量Table 5 Component and content of VAC in 8 individuals of C.tachangensis

根据香气特征[56]进行分析（表6），在8株大厂茶茶叶中排名前十位的VAC组分中，除了Q7中第十位的乙酸（有刺激性气味）含量为1.705%，前九位VAC组分呈花果香、强木香、青草香气、冬青味及脂肪香味，Q1～Q6、Q8的前十位VAC组分都呈花果香、强木香、青草香气、冬青味及脂肪香味。在8株大厂茶茶叶中排名前十位VAC组分含量的总和为64.582%～76.107%，在104种VAC组分总含量中占比较大，说明这十个组分可能是大厂茶茶叶表现出花香味、果香味、木香味、青草气、脂肪香味的重要因素。

表6 8株大厂茶茶叶中居前十位的挥发性芳香物质组分及其相对含量Table 6 Top ten of VAC components and contents in 8 individuals of C.tachangensis

3 结论与讨论

FAA可溶于水，是茶汤滋味的重要组成部分，人体通过饮茶获得味觉享受的同时也可摄取到多种氨基酸。在茶叶中已发现的FAA有二十多种，很多本身就是滋味因子，如茶氨酸有类似味精的鲜爽味和焦糖香气、谷氨酸有甜味和酸味、天冬氨酸有甜味、甘氨酸有独特的甜味、缬氨酸味微甜而后苦，组氨酸、亮氨酸、酪氨酸具有苦味[29,54-55]。本研究中，在8株大厂茶茶叶中，除了在Q7中检测到24种FAA组分、在Q8中检测到23种，在其余6株中均检测到25种，这25种FAA组分平均含量为0.048～3.276 mg·g-1。茶氨酸作为茶叶中特有的FAA组分，其含量和在FAA总量中的占比都最高，这与前人的研究结果[22-23]相一致，说明茶氨酸是FAA中最重要的组分，也是茶叶鲜爽味的主要组分。检测到的7种必需氨基酸（赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸）中，色氨酸为第一限制氨基酸。方差分析能有效检验均数差别的显著性，本研究中，25种FAA组分含量及总量的变异系数为11.513%～64.536%。多重比较结果显示，除了7种FAA组分在部分样树之间的差异不显著外，剩余样树之间的这7种FAA组分，以及其余18种组分和FAA总量在8株大厂茶之间的差异都较显著。这些都说明8株大厂茶之间的FAA差异较显著、多样性较丰富。

8株大厂茶茶叶的25种FAA组分中，呈鲜甜味[29,54-55]的FAA组分有12种，含量为5.913～13.529 mg·g－1，在FAA总量中的占比为56.853%～71.872%，说明呈鲜甜味的组分在总组分中占绝对优势，这可能是茶汤中鲜爽味及甜味的重要来源。但是由于茶汤滋味是由多种复杂的呈味物质综合形成，例如涩味受茶多酚类、茶黄素影响，苦味受生物碱类、花青素类、茶皂素影响，鲜爽味受氨基酸、茶黄素、儿茶素、咖啡碱络合物影响，甜味受氨基酸、可溶性糖类影响，酸味受有机酸、氨基酸影响，咸味受无机盐影响[22-23]，因此，对大厂茶茶叶滋味的进一步研究还应结合其他内含物成分。

如何有效地对种质资源进行评价，是优良种质筛选的关键，但是在利用多指标进行综合评判时，其分析结果常常会受到研究者主观意志的影响。主成分分析能将多个变量组合为几个新的综合变量，并找出数量较少又能尽可能多地反映原始变量信息的综合变量，从而达到简化的目的，既能反映原始变量的大部分信息，又能使所含信息不重复，因此广泛应用于品质综合评价及品质特征指标筛选中[57-65]。本研究中大厂茶茶叶中25种FAA组分经主成分分析可简化为4个主成分因子(PC1、PC2、PC3、PC4)，前4个主成分的累积贡献率为 87.825%，丝氨酸等13个组分反映了PC1对FAA的作用，缬氨酸等6个组分反映了PC2对FAA的作用，精氨酸等3个组分反映了PC3对FAA的作用，脯氨酸等3个组分反映了PC4对FAA的作用，因此，可以认为全部（25种）FAA组分才能反映出大厂茶FAA的特性，每种组分在FAA中都有自己的特性和贡献。

8株大厂茶中VAC的挥发规律基本一致，大部分VAC保留时间都在4～45 min，随着色谱柱柱温的升高，挥发出的VAC的量逐渐增多，到117℃左右（保留时间24 min左右）达到最大值，随后下降，说明在大厂茶茶叶中以低沸点（200℃以下）VAC的含量占了绝大部分。

从8株大厂茶茶叶中共鉴定出VAC组分104种，可分为醇类、醛类、酮类、烃类等10类化合物，以醇类、醛类为基础。主要呈香物质[22-23]包括15种，其中醇类有7种、醛类有5种、酮类有2种、酯类有1种，平均含量为76.688%，这与SONG[66]挥发性化合物中只有很少一部分在特征香气的呈现中起主要作用的观点一致。在8株大厂茶茶叶中都含有10类化合物，VAC组分种类丰富（为79～94种），但是8个单株的茶叶中每类化合物包含的VAC组分种类以及VAC组分含量占提取物总量百分比都存在一定差异。在8株大厂茶茶叶中，以Q5的主要呈香物质含量最高（79.488%），Q8的次之（79.284%），Q1的最低（70.808%）。从主要呈香物质的种类看，除Q5中只含14种外，其余7株中均含15种。但剔除单株中含量小于1%的主要呈香物质组分后，Q3、Q4、Q6的实际主要呈香物质为15种，Q1、Q2为14种，Q7、Q8为12种，Q5仅为11种，说明15种主要呈香物质对8个样株茶叶香味的贡献也存在一定的差异。

根据香气特征[56]对8株大厂茶茶叶中排名前十位的VAC组分进行分析，发现前十位VAC组分含量总和为64.582%～76.107%，在总含量中占比较大，说明这10个组分的香气特征可能是大厂茶表现出花香味、果香味、木香味、青草气、脂肪香味的重要因素，在大厂茶成茶加工中形成其独特的香气特征方面可加以利用。但是由于茶叶香气还受其他生化成分、茶叶香气前体物质[19-20]、加工过程中物质转化等影响，因此对大厂茶香气的进一步研究还应结合生物化学、酶学、加工工艺学等进行。

本研究中，对大厂茶茶叶中FAA的组分、含量、特性、呈味特征，VAC的组分种类、含量、主要呈香物质含量和贡献、香气特征等的研究结果，为大厂茶的进一步深入研究提供了基础数据，在后期的优良单株选育、优质原材料筛选及成茶加工中都可进行运用。