miR-614过表达抑制肺腺癌A549细胞增殖、侵袭及裸鼠移植瘤生长

黎亮，蔡仁中，李高，黄修明

(海南省人民医院胸外科，海南 海口 570311)

肺癌是一种常见的恶性程度较高的呼吸系统肿瘤。据统计，肺癌的发病率在男性恶性肿瘤患者中居于第一位，在女性患者中居于第二位，其死亡率在男性和女性恶性肿瘤患者中均居于首位[1]。肺癌的病因复杂，其发生机制尚未完全明确，临床治疗采用外科手术尽可能切除病变组织，同时联合术前或术后放化疗，以期延长生存时间，但术后生存率仍较低[2]。近年，有研究[3-4]研发了肺癌的分子靶向药物，并将其应用于临床研究，发现分子靶向药物可明显延长患者的生存期。研究肺癌发生和进展机制，以指导临床新靶向药物研发，获得了研究者们的广泛关注。miR-614是新发现的一种与癌症有关的miRNA，在卵巢癌[5]和胰腺癌[6]中均表现出了异常的高表达，且过表达miR-614可以抑制肿瘤细胞的增殖。然而，部分研究[7]显示，miR-614过表达可以调节嘌呤霉素敏感性氨肽酶的表达，抑制肺癌细胞增殖和侵袭，但miR-614在肺癌中的具体作用尚不明确。本研究分析了miR-614过表达对肺癌细胞生长和侵袭的影响，旨在为肺癌患者的临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料与仪器

BALB/C裸鼠，36只，雄性，鼠龄4～5周，体质量18～22 g，平均(20±2)g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物许可证号SCXK(京)2016-0006]，保持室温恒定为25 ℃，模拟昼夜每12 h更换1次光照条件，动物自由摄食与饮水。

人A549细胞购自中国中科院上海细胞所；RPMI1640培养基、胎牛血清、RT-qPCR试剂盒均购自中国北京索莱宝科技有限公司；miR-614 mimic(序列54～76位点5’-GAA CGC CUG UUC UUG CCA GGU GG-3’)及其阴性对照miR-NC mimic(序列5’-CAG UAC UUU UGU GUA GUA CAA-3’)均由中国上海吉凯基因有限公司合成；LipofectamineTM 2000转染试剂盒购自中国上海远慕生物科技有限公司；RT-qPCR引物均由中国上海生工生物工程有限公司合成；CCK-8检测试剂盒(货号：KTC011001)和Transwell小室(货号：K917-24)均购自中国艾美捷科技有限公司；内参β肌动蛋白(β-actin，货号：13653S)、兔抗人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(货号：2463S)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP)(货号：4022S)、金属蛋白酶组织抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)(货号：5738S)、Ki-67抗体(货号：9129S)及辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔二抗(货号：14708S)均购自美国CST公司。MK3型全自动酶标仪购自Thermo Scientific公司；3111型CO2培养箱购自Thermo Scientific公司；7500 RT-PCR系统购自于美国Applied Biosystems；光学显微镜(BX60型)购自日本Olympus公司。

1.2 A549细胞培养和分组

采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养A549细胞，在温度37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养24 h。将对数生长期A549细胞分为对照组、miR-NC组和miR-614组。miR-614组按照LipofectamineTM2000转染试剂操作步骤进行细胞转染，取培养至对数生长期的细胞，用2.5%胰蛋白酶消化、收集细胞，以1×103个/孔细胞接种于12孔板内，待细胞生长至50%左右融合时，进行转染操作，每孔板加入20 pmol的miR-614 mimic(终浓度为10 pmol/mL)和10 μL的转染试剂，转染5 h后，更换正常培养基培养。miR-NC组转染miR-NC，对照组不进行转染操作。

1.3 RT-qPCR检测各组细胞miR-614表达

将培养至对数生长期A549细胞，采用RT-PCR检测各组细胞miR-614表达，miR-614上游引物：5’-AAA GAC ATA GGA TAG AGT CAC CTC-3’，下游引物：5’-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3’，扩增片段72bp；内参为U6，上游引物：5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游引物：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’，扩增片段94bp；采用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.4 CCK-8检测A549细胞增殖

将培养至对数生长期A549细胞制备成单细胞悬液，以1×103个/孔将接种于96孔培养板中，于温度37℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，分别在培养的0、24、48、72和96 h，严格按照试剂盒的说明进行CCK-8检测，酶标仪检测波长为450 nm处各孔吸光度值。

1.5 Transwell检测A549细胞侵袭

将培养至对数生长期A549细胞制备成单细胞悬液，以2×105个/mL接种于24孔培养板中，取100 μL加于上室，培养48 h后，取出Transwell小室，常规固定和染色，显微镜下观察并计数膜下室表面细胞数。

1.6 Western Blot检测A549细胞VEGF、MMP-2、Ki-67蛋白表达

取培养至对数生长期A549细胞，提取细胞中的总蛋白并根据试剂盒进行蛋白定量，经凝胶电泳、转PVDF膜，脱脂牛奶封闭，加一抗VEGF(1∶200)、MMP-2(1∶500)、Ki-67(1∶500)，4 ℃孵育过夜，加二抗(1∶4 000)，室温孵育2 h，显影，以β-actin(1∶500)为内参，分析蛋白相对表达量。

1.7 裸鼠移植瘤模型建立

A549细胞悬液制备：取各组培养至对数生长期的A549细胞，收集细胞，重悬，调整细胞浓度为5×106/mL。

36只裸鼠于室温、昼夜光照、自由摄食与饮水条件下预饲养7 d，随机分为对照组、miR-NC组和miR-614组，每组12只。miR-NC组和miR-614组裸鼠，在背部尾侧皮下种植0.2 mL对应组A549细胞悬液(5×106/mL)，建立裸鼠移植瘤模型，肉眼可见皮下成瘤，即为造模成功。对照组注射等体积生理盐水。每周测量1次，计算移植瘤体积=0.5×最小径2×最大径，背部尾侧皮下接种5周后，切除移植瘤组织并称重。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 各组A549细胞中miR-614表达

miR-614 mRNA的表达水平在A549细胞miR-614组高于miR-NC组(2.75±0.31vs.0.38±0.05，P<0.05)，miR-NC组细胞miR-614水平与对照组比较，差异无统计学意义(0.38±0.05vs.0.37±0.04，P>0.05)。

2.2 各组A549细胞的增殖情况

miR-614组A549细胞增殖活性低于miR-NC组(P<0.05)，miR-NC组细胞增殖活性与对照组无明显差异(P>0.05)。见图1。

2.3 各组A549细胞侵袭细胞数

miR-614组A549细胞侵袭细胞数低于miR-NC组(74.21±10.96vs.127.34±17.66，P<0.05)，miR-NC组细胞侵袭细胞数与对照组比较，差异无统计学意义(127.34±17.66vs.129.48±18.52，P>0.05)。见图2。

2.4 各组A549细胞VEGF、MMP-2、TIMP-2、Ki-67蛋白表达

miR-614组A549细胞VEGF、MMP-2和Ki-67蛋白表达低于miR-NC组(P<0.05)，TIMP-2蛋白表达高于miR-NC组(P<0.05)；miR-NC组细胞VEGF、MMP-2、TIMP-2和Ki-67蛋白表达与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.5 各组裸鼠移植瘤的生长

miR-614组裸鼠移植瘤质量低于miR-NC组[(1.41±0.46)gvs.(2.63±0.42)g，P<0.05]，miR-NC组裸鼠移植瘤质量与对照组无明显差异[(2.63±0.42)gvs.(2.60±0.41)g，P>0.05)]；且造模3周、4周和5周后，miR-614组裸鼠移植瘤体积低于miR-NC组(P<0.05)，miR-NC组裸鼠移植瘤体积与对照组无明显差异(P>0.05)。见图4。

3 讨论

肺腺癌A549细胞来源于非小细胞癌，是一种较为常见的肺癌，约占所有肺癌的80%，生存率较低，临床主要采用手术切除联合术前或术后的放化疗，以期尽可能清除病灶组织，延长生存时间[8]。miR-614是一种新型miRNAs，可以调节多种靶mRNA的表达，并调控细胞的增殖、分化、凋亡等多种病理生理过程[9]。miR-614的表达与肺癌细胞的转移有关，且miR-614的高水平表达可以抑制细胞的恶性生物学行为[10]。本研究进行了脂质体转染，以探讨miR-614过表达对A549细胞生长的影响，结果显示miR-614过表达可以显著抑制Ki-67蛋白表达和A549细胞的增殖活性。Ki-67是一种常用的A549细胞增殖标记蛋白，其表达水平随细胞有丝分裂进程而变化，在细胞有丝分裂的G0期几乎不表达，到细胞有丝分裂的G1期后期开始出现表达，S期、G2期表达均表现持续升高的趋势，在有丝分裂的M期的表达水平最高，而后随着有丝分裂进程的结束，Ki-67表达迅速降解[11-12]。Xu等[13]研究显示非小细胞癌患者癌组织中Ki-67蛋白表达水平与肿瘤的进展有关，其高表达患者的预后较差，可用于临床预后评估，提示miR-614过表达可以Ki-67蛋白表达，抑制A549细胞增殖，抑制肺癌的进展。

本研究结果显示miR-614过表达可以显著MMP-2蛋白表达，抑制A549细胞侵袭。MMP-2属于MMPs家族，其催化区结构中包含半胱氨酸的嵌入物，在生理静息状态下一般被结构中的前肽区遮挡，当MMP-2被激活后，这些嵌入物可以结合并裂解明胶、胶原和弹性蛋白，降解细胞外基质，还可以调节肿瘤细胞之间的黏附，促进血管生成和细胞侵袭[14]。TIMP-2是主要由肿瘤细胞及间质细胞分泌的MMP-2蛋白抑制因子，可以抑制MMP-2的活性，保护细胞外基质和基膜的完整性，抑制肿瘤细胞发生侵袭[15]。Cao等[16]研究显示，MMP-2/TIMP-2蛋白表达可以调节肺癌细胞的侵袭能力、黏附能力、血管形成等，是促进肺癌浸润转移的关键。因此，miR-614过表达可以抑制MMP-2/TIMP-2蛋白表达，抑制A549细胞侵袭。

本研究中，miR-614过表达可以显著抑制肺腺癌A549细胞中VEGF蛋白表达。VEGF是细胞内最主要的促血管生成因子，可以促进肿瘤细胞血管形成，在肺癌的进展中具有重要作用[17]。研究[18-19]显示，VEGF蛋白表达升高可以通过促进血管形成，改变肿瘤细胞微环境，为肿瘤细胞提供丰富的营养，促进A549细胞的增殖活性，提示miR-614过表达可能通过VEGF蛋白表达，抑制肺癌细胞增殖。Deng等[20]研究显示，VEGF可以直接或间接促进MMP-2表达，促进肿瘤细胞的侵袭，同时VEGF诱导的血管形成也可以为癌细胞的侵袭和转移提供通道，促进肺癌的恶性进展。研究结果表明，miR-614过表达可以抑制肺腺癌A549细胞中VEGF蛋白表达，抑制A549细胞的增殖活性和侵袭能力。本研究中，miR-614过表达可以降低裸鼠移植瘤组织的体积，减轻移植瘤质量，提示miR-614过表达可以抑制移植瘤的生长，结果与细胞实验基本一致，说明miR-614过表达可以抑制肺癌的生长和转移。

综上所述，miR-614过表达可以抑制VEGF、MMP-2/TIMP-2和Ki-67蛋白表达，抑制肺腺癌A549细胞的增殖活性和侵袭能力，抑制移植瘤组织的生长和转移，临床有望作为肺癌治疗的新靶点。但本研究尚处于初步研究阶段，样本量较小，仍需大样本量的细胞水平和动物水平实验加以验证。