三阴乳腺癌中MIR892B和CDK1的基因拷贝数变异与患者恶性进展的相关性分析*

王智辉，钟媚共，孟子杰，伍婉婷，陈秋旋，郑 焱，张 鑫△

(1.广东省江门市中心医院肿瘤科 529030；2.广东省江门市妇幼保健院药学部 529000；3.广东省江门市中心医院医学研究中心 529030；4.广东省人乳头状瘤病毒(HPV)相关疾病分子诊断工程技术研究开发中心，广东潮州 521021)

乳腺癌(breast cancer)是最常见的女性特发恶性肿瘤，其发病率居首位，且呈上升趋势，严重威胁女性健康[1-2]。按浸润性生长状态，可分为原位癌和浸润癌，并以浸润性乳腺导管癌(infiltrating ductal carcinoma of breast,IDC)为临床的主要病理类型[3]。虽然外科手术依然是治疗浸润性乳腺癌的基础，但是对于进展期及复发转移的乳腺癌，化疗、内分泌治疗及靶向治疗等的系统治疗手段更为重要[4]。然而，有类特殊亚型的乳腺癌——三阴乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)的肿瘤生物学特征更为恶性，且因缺少靶点，无法使用内分泌治疗药物及常规靶向药物，5年内发生术后进展情况较其他亚型严重[5-6]，是乳腺癌临床治疗中的瓶颈。临床诊治中，TNBC属排除性分类，为雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)及人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)阴性，HER2编码基因ERBB2无扩增的浸润性乳腺癌[3]。研究指出[3,5,7]，TNBC占全部浸润性乳腺癌的10%～20%，我国及非洲裔人TNBC的比例较其他国家或种族高。在预后观察中，TNBC的特点是有较高的5年内进展率(约25%)，而较为稳定的长期(10～20年)无进展率(约70%)[8]，导致部分患者迅速进展的机制依然不清，也少见基因组拷贝数变异(copy number variations,CNV)在TNBC恶性进展中的作用报道。因此，本课题组将尝试利用全基因组CNV分析结合临床样品验证，找出与TNBC恶性进展相关的基因。

1 资料与方法

1.1 一般资料

参考本课题组已发表文献[9]，下载癌症基因组图谱数据库(the cancer genome atlas,TCGA)中乳腺癌的基因组拷贝信息(由Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片过滤得到)及对应样品的临床信息，数据库的更新下载时间为2020年1月31日。利用临床信息中ER、PR和HER2的免疫组织化学染色结果及ERBB2DNA原位杂交结果，筛选出ER和PR免疫组织化学为阴性，同时HER2免疫组织化学阴性或ERBB2非扩增的TNBC 153例。在GenePattern公共服务器平台(https://genepattern.broadinstitute.org/)上，利用GISTIC 2.0软件分析肿瘤组织的全基因组拷贝信息，其中原始拷贝数信息源自TCGA下载整理，参考基因组为人类19版基因组(human genome 19,hg19)，探针标记的物理位点信息(Markers file)和CNV参照信息(CNV file)均整理自SNP Array 6.0的第35版本信息(http://www.affymetrix.com/)；关键的运行参数均为默认，并分析X染色体的CNV情况。运行所得的关键数据：(1)每个探针标记位点的扩增或缺失情况，即G评分，G评分的高低能综合反映该位点的扩增或缺失的深度和频率；(2)每个样品中单个基因的CNV情况，包括缺失、二倍体和扩增。

收集整理2012年1月至2015年12月在江门市中心医院就诊的TNBC患者88例资料，均为手术标本，鉴别诊断参考已发表文献及共识。

两群样品在性别、年龄、病理类型及TNM临床分期的分布差异均无统计学意义(P>0.05)，但在5年内的预后事件发生情况上有差异(P<0.001)，原因是TCGA的5年内随访并不完善，见表1。

表1 TCGA及江门市中心医院TNBC患者的基本信息

续表1 TCGA及江门市中心医院TNBC患者的基本信息

1.2 qPCR检测石蜡标本的CDK1基因和MIR892B基因CNV

参考本课题组已发表文献[9]，调取患者手术标本中肿瘤成分70%的石蜡组织，10 μm厚度切片4张。按GeneRead DNA FFPE试剂盒操作说明书提取石蜡切片的DNA；利用TaqMan Copy Number Assay的荧光定量PCR引物Hs02504302_cn检测CDK1基因拷贝数，引物Hs05702773_cn检测MIR892B基因拷贝数，其中内参引物为TaqMan Copy Number Reference Assay RNase P，二倍体参考样品为健康人血浆白膜层样品，扩增试剂盒为TaqMan Fast Advanced Master Mix，按说明书在CFX96荧光定量PCR仪中检测。规定样品中目标基因的相对拷贝数检测值小于0.75为缺失，大于1.50为扩增，其余为二倍体。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism7.0统计软件进行分析。计数资料以频数表示，采用χ2检验或Fisher′s精确检验；生存分析采用Kaplan-Meier分析方法及log-rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义(P<0.05)。

2 结 果

2.1 TCGA中TNBC预后相关的扩增区段分析

通过GISTIC 2.0软件分别对TCGA中27例5年无进展和32例5年有进展的TNBC患者肿瘤组织进行全基因组CNV分析，结果显示3p26.1、10q21.2和19q12在有进展肿瘤组织中明显扩增，6p21.1、11q13.4和Xq27.3在无进展肿瘤组织中明显扩增，见图1。

2.2 TCGA中TNBC预后相关的缺失区段分析

32例5年有进展患者肿瘤组织存在明显缺失情况的染色体区段为4p13和12q24.32，在27例5年无进展患者肿瘤组织中发生明显缺失的为13q22.2和19p13.3，见图2。

2.3 TCGA中各CNV热点基因与5年进展事件的相关性

利用IGV软件并结合文献报道，确定各区段的扩增或缺失关键基因：3p26.1为碱性螺旋-环-螺旋家族成员基因E40(BHLHE40)、6p21.1为细胞周期蛋白D3(CCND3)、10q21.2为细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、11q13.4为微小RNA-139(MIR139)、19q12为细胞周期蛋白E1(CCNE1)、Xq27.3为微小RNA-892B(MIR892B)、4p13为泛素C末端水解酶L1(UCHL1)、12q24.31为跨膜蛋白132B(TMEM132B)、13q22.2为泛素C末端水解酶L3(UCHL3)和19p13.3为丝氨酸/苏氨酸激酶11(STK11)。只有MIR892B的扩增情况能够在TCGA中显著区分TNBC患者的5年无进展预后(χ2=4.300，P=0.038)。进一步利用两两组合的方式显示，将MIR892B的非扩增或CDK1的扩增作为阳性指标，能更好地区分TNBC患者的5年无进展预后(P=0.008)，见表2。

表2 TCGA中各CNV热点基因与5年内进展事件的相关性[n(%)]

2.4 TCGA中CDK1和MIR892B CNV与患者无进展预后的相关性

将MIR892B的非扩增或CDK1的扩增患者定义为指标阳性组(n=115)，余下的为指标阴性组(n=26)，指标阳性组的无进展预后要明显差于指标阴性组(P=0.010)，见图3。

图3 TCGA中无进展预后曲线图

2.5 江门市中心医院样品中CDK1和MIR892B CNV与5年进展事件的相关性

在江门市中心医院样品中分别检测了CDK1和MIR892B的CNV，只有MIR892B的扩增情况能够显著区分患者的5年无进展预后(χ2=4.616，P=0.032)，将MIR892B的非扩增或CDK1的扩增作为阳性指标，能更好地区分TNBC患者的5年无进展预后(P<0.001)，见表3。

表3 CDK1和MIR892B的拷贝数变异与5年进展事件的相关性[n(%)]

2.6 江门市中心医院样品中CDK1和MIR892B CNV与患者无进展预后的相关性

在江门市中心医院TNBC患者的癌组织中，将MIR892B的非扩增或CDK1的扩增患者定义为指标阳性组(n=68)，余下的为指标阴性组(n=20)，指标阳性组的无进展预后明显差于指标阴性组(P=0.001)，见图4。

图4 江门市中心医院样品中无进展预后曲线图

3 讨 论

近二十年来，精准医学从概念逐步走到临床，乳腺癌的诊治就是其发展的范例之一；将分子特征检测技术与传统肿瘤病理诊断相结合，有力地推动了乳腺癌的精准诊治，成熟的乳腺癌分子特征主要包括了关键驱动基因的突变、CNV及蛋白产物的异常表达等。在关键驱动基因的CNV中，癌基因ERBB2的扩增在乳腺癌中最具有临床意义，一方面，ERBB2的扩增是明确的乳腺癌患者不良预后的标志物，是癌蛋白HER2过表达的主要原因[10]；另一方面，针对HER2蛋白为靶点的曲妥珠单抗，在治疗转移性HER2过表达型乳腺癌中疗效确切，能有效延长相适应分型患者的生存时间，而ERBB2的扩增检测是重要的伴随诊断检查[11]。但是对于TNBC，暂时未见可以用于诊治的关键驱动基因CNV特征，探讨与TNBC预后相关的CNV具有潜在的临床应用开发价值。

一般认为，肿瘤基因组中发生扩增的区段一般包含了重要的癌基因，而缺少的区段则往往含有关键的抑癌基因[12]。利用基因组浏览器及文献调研，笔者分别确定了各个区段的热点基因，在进展组中发生明显扩增的是与细胞周期运行密切相关的CDK1(10q21.2)和CCNE1(19q12)[13]，被证实与乳腺转移密切相关的转录因子BHLHE40(3p26.1)[14]，发生明显缺失的有泛素化途径相关基因UCHL1(4p13)和跨膜蛋白TMEM132B(12q24.31)；在无进展组中发生明显扩增的是周期相关蛋白CCND3(6p21.1)和两个明确的起抑癌作用的MIR139(11q13.4)[15]、MIR892B(Xq27.3)[16]，发生明显缺失的为泛素化途径相关基因UCHL3(4p13)和蛋白激酶STK11(19p13.3)。预后相关性分析发现，仅MIR892B的非扩增与TNBC患者5年进展预后相关，且MIR892B扩增及CDK1非扩增的TNBC患者具有好的无进展预后，而这一结果在江门市中心医院样品中得到了验证，表明了MIR892B的扩增是TNBC患者好的预后相关因子，而CDK1的扩增是TNBC患者差的预后相关因子。CDK1作为细胞周期调控相关蛋白，在S期与Cyclin A结合参与细胞S～G2期转换，在G2期与Cyclin B结合参与细胞G2～M期转换，是肿瘤细胞周期运行及增殖的关键蛋白，也是新型抗肿瘤药物开发的重要靶点[17]，但是关于CDK1的CNV在恶性肿瘤中的诊断报道较少。本研究发现，CDK1的扩增能影响TNBC患者预后，但相关性较MIR892B的非扩增差，提示在TNBC恶性进展中MIR892B的作用更明显。

在前期研究中，笔者率先报道[16]了miR-892b在乳腺癌组织及细胞中表达明显下调，且其表达越低患者的临床分期越高、生存预后越差；在体内外实验中，抑制miR-892b能促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭、皮下成瘤及肺定殖生长，过表达则起抑制作用，其作用机制可能与miR-892b能同时靶向抑制维持NF-κB通路激活的负调控因子TRAF2、TAB3和TAK1有关。前期，笔者观察到miR-892b编码基因MIR892B的启动子位置有甲基化位点，其在乳腺癌中低表达的原因与启动子甲基化有关[16]，而本研究显示，MIR892B(Xq27.3)在TNBC肿瘤组织中存在扩增，而MIR892B(Xq27.3)的扩增是与TNBC好的预后相关，进一步说明了miR-892b的低表达与乳腺癌特别是TNBC患者差的预后相关。近期，在非小细胞肺癌中笔者观察到具有抑癌活性的肝性白血病因子(hepatic leukemia factor,HLF)，其低表达同时受编码基因的CNV和启动子甲基化水平调控，综合两因素的联合指标更能反映HLF的表达水平[9]。MIR892B的CNV与启动子甲基化的联合指标是否能预测TNBC患者的预后是课题组后续的研究方向。