二甲双胍对骨骼肌异位脂肪沉积的作用机制研究

郑 晖，全军承，程 绩，周人杰

(陆军军医大学第二附属医院急诊科，重庆 400037)

骨骼肌异位脂肪沉积是机体发生糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗和2型糖尿病的重要原因[1-2]。围脂滴蛋白(perilipin，PLIN)是最具代表性的脂滴包被蛋白，它直接或间接参与骨骼肌的脂质代谢，与脂滴的动态平衡、脂质代谢稳态及靶器官胰岛素敏感性关系密切[3-5]。有研究证实，PLINs的表达受腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)[6]和过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)信号通路的调控[7]。二甲双胍是临床上防控糖尿病的一线药物，它能激活AMPK信号通路，增强骨骼肌的胰岛素敏感性。因此，本研究旨在探讨二甲双胍是否通过AMPK-PPARδ-PLINs信号通路抑制骨骼肌异位脂肪沉积，从而改善胰岛素抵抗。

1 材料与方法

1.1 材料

8周龄C57BL/6J小鼠24只由陆军军医大学实验动物中心提供，分笼饲养在SPF级动物房，自由饮水觅食、恒温。标准饲料和60%高脂饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。二甲双胍购自美国Sigma公司；欧姆龙血糖仪、配套血糖试纸，以及胰岛素(INS)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和游离脂肪酸(FFA)检测试剂盒购自上海酶联生物有限公司；一抗PLIN2和PLIN5购自英国Abcam公司，一抗AMPK、PPARδ、p-AMPK购自美国Cell Signaling公司；DNA提取试剂盒购自凯杰公司；PCR和逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。PLIN1:上游引物TGGAAACTGAGGAGAACAAG，下游引物ATGTCACAGCCGAGATGG;PLIN2:上游引物GAAACTGAGGAGAACACATCA，下游引物TGTCACGACATCAGCCA;PLIN3:上游引物TATTGGATCCGTACAGCCCAG，下游引物TATTAAGCTTGCCCCACGAC;PLIN4:上游引物TAACCCTATTATCTCTCCCT，下游引物GGTGTTTTAGGATTGACAT;PLIN5：上游引物GGTGACATCAGCCAAGGATACAG，下游引物TCCACCAGCTTCTCCGACTT;18s RNA:上游引物CGCAAATTACCCACTCCCGAC，下游引物GTAACCTCCCGTTCAGACCAC。

1.2 方法

1.2.1实验分组

本研究经陆军军医大学第二附属医院伦理委员会审查批准实验。将小鼠分为对照组(ND组)、高脂组(HF组)、高脂+二甲双胍组(HF+Met组)，每组8只。ND组喂养标准饲料，HF和HF+Met组喂养高脂饲料。二甲双胍溶于水中，每日按照250 mg/kg的计量给予HF+Met组小鼠灌胃。每周称重1次，持续喂养16周，空腹隔夜后剪鼠尾取血检测血糖。乙醚麻醉心脏取血，颈椎脱臼处死小鼠，取材做如下实验。

1.2.2ELISA检测血清脂代谢相关生化指标水平

心脏取血，静置2 h后3 000 r/min离心10 min,吸取上层血清分装入新的EP管中，按照INS、TG、TC、LDL-C、HDL-C和FFA检测试剂盒说明书检测其水平。

1.2.3骨骼肌油红O染色

比目鱼肌切成1 cm×1 cm的方块于OCT包埋剂中，放入液氮中急冻20 s，冰冻切片成16 μm厚切片，在4%多聚甲醛溶液中固定10 min，清水冲洗载玻片。将载玻片浸泡在60%异丙醇中30 s，在油红O溶液中室温孵育15 min。60%异丙醇洗2次，清水洗2 min，苏木精复染30 s后用水清洗过量的苏木精。索尼数码相机光镜400倍，取油红O染色比目鱼肌照片。

1.2.4骨骼肌内TG水平测定

取比目鱼肌组织50 mg，加入200 μL的PBS，组织匀浆机尽量破碎组织，4 ℃ 3 000 r/min离心15 min。提取上清液按照试剂盒说明书检测。

1.2.5PCR检测PLINs mRNA表达

提取比目鱼肌组织RNA，取1 μL检测RNA的浓度和纯度，检测PLINs mRNA表达，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.6Western blot检测AMPK、PPARδ、p-AMPK、PLIN2和PLIN5表达

取比目鱼肌组织20 mg，加入蛋白裂解液300 μL，冰上匀浆裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min,提取上层清液测定蛋白浓度，煮沸10 min变性蛋白。上样、电泳、转膜结束后，放入10%脱脂牛奶中封闭2 h，加入AMPK、PPARδ、p-AMPK、PLIN2和PLIN5一抗过夜。加入相应二抗，曝光后Image J进行灰度值分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组血清糖、脂代谢相关生化指标比较

与ND组比较，HF组中小鼠体重、血清中糖代谢相关生化指标[空腹血糖(FBG)与空腹血胰岛素(FINS)]及脂代谢相关生化指标(TG、TC、LDL-C和FFA)水平明显升高(P<0.05)，二甲双胍干预后，体重、FBG、 FINS、TG、TC和FFA等指标较HF组明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 各组糖、脂代谢相关生化指标比较

2.2 各组骨骼肌脂滴(LD)和TG水平比较

HF组中红色LD的数量明显增多(P<0.05)，TG水平明显升高(P<0.05)，二甲双胍干预后LD和TG水平明显降低(P<0.05)，见图1。

A：油红O染色(×400)；B：TG水平；*：P<0.05,与ND组比较;#：P<0.05,与HF组比较。

2.3 各组PLINs表达比较

PLIN1在比目鱼肌组织不表达；各组PLIN3、PLIN4 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；HF组中PLIN2、PLIN5 mRNA和蛋白表达明显高于ND组(P<0.05)；二甲双胍干预后，PLIN2 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05)，而PLIN5表达未见明显变化(P>0.05)，见图2、3。

*：P<0.05,与ND组比较;#：P<0.05,与HF组比较。

2.4 各组AMPK、PPARδ蛋白表达比较

与ND组比较，HF组p-AMPK、PPARδ蛋白表达明显降低(P<0.05)，二甲双胍干预后，p-AMPK和PPARδ蛋白表达明显升高(P<0.05)，见图3。

*：P<0.05,与ND组比较;#：P<0.05,与HF组比较。

3 讨 论

肥胖已成为全球性的重大公共卫生问题，我国肥胖形势不容乐观，平均肥胖率高达12%，并且呈现出年轻化趋势[8]。肥胖一方面将过剩的能量以TG的形式储存于脂肪组织中，另一方面过多的FFA进入到其他非脂肪组织中，引起异位脂肪沉积，其中骨骼肌异位脂肪沉积在胰岛素抵抗的发生、发展中起着至关重要的作用[1-2]。因此，如何有效地防止骨骼肌异位脂肪沉积已成为防治胰岛素抵抗，甚至2型糖尿病的重点。本文通过高脂诱导建立小鼠肥胖模型，发现二甲双胍逆转了在高脂诱导下小鼠糖、脂代谢异常，骨骼肌中LD增多，TG水平和PLIN2 mRNA、蛋白表达升高，p-AMPK、PPARδ蛋白表达降低。高脂诱导下PLIN5 mRNA和蛋白表达明显升高，而二甲双胍干预后它的表达水平有所下降，但无明显变化。

PLINs是典型的脂滴包被蛋白，家族中5个亚型都不同程度地参与LD的合成、生长、转运及降解。但是5个亚型的表达具有组织特异性。PLIN1主要表达在脂肪和类固醇细胞中，在骨骼肌中不表达[9]。PLIN2在脂肪细胞和骨骼肌细胞中高表达，它的表达量与骨骼肌中LD呈明显的正相关，并且能与脂肪分解的限速酶相互作用[10]。研究表明胫骨前肌过表达PLIN2增加了肌肉中TG水平及LD的大小、数量，在培养的肌管细胞中PLIN2的下调阻止了油酸诱导的LD储存，这些证据推测PLIN2可能参与了LD的合成和生长[11]。本研究发现，在高脂模型的比目鱼肌组织中的TG水平、LD数量、PLIN2 mRNA和蛋白表达明显升高，二甲双胍干预后PLIN2表达随着TG水平和LD数量减少而降低。但是值得思考的是，到底是由于LD的变化导致PLIN2变化还是由于PLIN2变化引起LD变化，二者的因果关系还需今后进一步的实验研究。本研究发现，PLIN3在骨骼肌中表达，但是在高脂模型和高脂+二甲双胍干预模型下PLIN3表达水平并无明显变化。而之前有证据显示，在AMPK的激动剂作用下，股四头肌中PLIN3表达水平明显升高[12]。二甲双胍作为AMPK的激活剂，在本研究中并未表现出刺激PLIN3的作用，这可能与实验的肌肉取材相关，比目鱼肌主要是以慢肌纤维为主，而股四头肌是混合型肌纤维，肌纤维类型的差别导致了PLIN3表达的差异性。

PLIN5主要在肝脏、脂肪、心脏和骨骼肌等氧化代谢高的组织中[13]。BOSMA等[14]发现骨骼肌中过表达PLIN5导致了肌内TG水平升高，推测其可能作为脂质屏障，保护LD不受脂肪酶水解活性的影响。本研究同样发现在高脂模型下，骨骼肌内TG和LD升高，PLIN5 mRNA和蛋白表达也明显升高。二甲双胍干预后，肌内TG和LD降低，但是PLIN5表达并无明显变化。前期研究显示，PLIN5不仅定植于LD表面，还定位在细胞质和线粒体中，并且它的转录活性受PPARδ调控。BINDESBØLL等[15]发现PLIN5的基因结构域中存在PPAR功能性结合位点，并且证实PLIN5可作为PPARδ在肌肉组织中的直接作用靶点，长链脂肪酸诱导PLIN5转录活性增加依赖PPARδ的表达。LAURENS等[13]推测，在骨骼肌氧化代谢需求增强时，PLIN5作为LD和线粒体之间沟通的桥梁，促进脂肪酸转运入线粒体，增强脂肪分解代谢。因此，笔者认为在高脂诱导下，LD表面的PLIN5表达升高协同PLIN2促进过多的FFA以TG的形式储存在肌细胞中，而二甲双胍作为AMPK激活剂，当氧化代谢增强时，细胞质和线粒体PLIN5表达升高促进脂肪酸有氧氧化。本课题组后续将针对PLIN5的定位变化深入研究。

综上所述，二甲双胍可能通过AMPK-PPARδ信号通路调控PLIN2、5表达和定位，抑制骨骼肌中LD生成和TG水平，进而改善胰岛素抵抗。