3-羟基根皮苷对小鼠血糖及糖异生关键酶G-6-Pase的影响

汪鋆植 边 宇 邓改改，2 吴 翠 李 澳 廖兴悦 黄永梅

(1.三峡大学 天然产物研究与利用湖北省重点实验室/湖北省土家族医药研究所，湖北 宜昌 443002；2.三峡大学 医学院，湖北 宜昌 443002)

3-羟基根皮苷是湖北海棠茶中主要成分之一[1]，湖北海棠(Malushupehensis(Pamp.)Rehd.)药食两用，已被收录于《湖北中药材质量标准》[2]中，具有降血糖、抗氧化、保肝护肝、减毒[3]等多种功效.湖北海棠嫩叶经过发酵加工制成的代用茶称海棠茶.湖北海棠叶中含丰富的黄酮类化合物，其中含量最高的为根皮苷(3.26～52.23 mg/g)，其次是3-羟基根皮苷(4.29～40.29 mg/g).文献研究表明，根皮苷具有改善胰岛素抵抗[4]、胰岛素增敏、抑制葡萄糖共转运蛋白[5]、增强糖耐量、抑制糖异生[6]等作用，而且根皮苷已广泛用于降糖药物的研发，卡格列净、达格列净、恩格列净等降糖药物就是以根皮苷为前体合成[7].研究表明湖北海棠具有降糖作用，其作用可能是多成分、多靶点作用的结果.3-羟基根皮苷具有与根皮苷类似的结构，但少有对3-羟基根皮苷降糖作用的报道，所以本文对3-羟基根皮苷降糖作用进行研究，并观察其对血糖稳态的影响，为进一步探讨海棠茶中不同成分降糖作用的相互关系，更合理利用海棠茶提供依据.

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

3-羟基根皮苷(由三峡大学天然产物研究与利用实验室提供，纯度98%，湖北海棠叶中分离)；肝癌细胞HepG2(南京科佰生物有限公司)；昆明小鼠(雌雄各半，体重(20±2.0)g)(三峡大学动物实验中心提供，spf级昆明小鼠)；DMEM高糖型培养基(高于4 500 mg/L)(美国Gibco公司)；磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffersaline)(solarbio公司)；胰蛋白消化酶(美国Sigma公司)；噻唑蓝(MTT)(美国Amresco公司)；血糖测试仪(三诺生物传感技术股份有限公司)；葡萄糖测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RIPA裂解液(radio-immuno precipitationassay)(solarbio公司)；二甲双胍(美国Sigma公司产品).

1.2 方法

1.2.1 胰岛素抵抗模型HepG2细胞的建立

参考许乐等[8]方法建立胰岛素抵抗模型，复苏HepG2细胞，二氧化碳培养箱中常规培养.待细胞完全贴壁并长满培养瓶80%以上，生长状态良好时，进行细胞传代，在DMEM培养基中加入10-6mol·L-1胰岛素，作用时间48 h，诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗.

1.2.2 3-羟基根皮苷对胰岛素抵抗模型HepG2细胞存活率的影响

取对数生长期的胰岛素抵抗HepG2细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板，100 μL/孔，贴壁生长12 h后，加入100 μL/孔不同浓度3-羟基根皮苷，终质量浓度分别为120、100、80、60、40 μg/mL，每个质量浓度设定3个复孔，分别培养24 h、48 h后，MTT法检测细胞的存活率，根据[OD(对照组)/OD(给药组)]×100%=相对存活率，计算相对存活率.

1.2.3 3-羟基根皮苷对胰岛素抵抗模型HepG2细胞摄入葡萄糖的影响

取对数生长期的胰岛素抵抗模型HepG2细胞，以3×104个/mL密度接种于24孔板，200 μL/孔，贴壁生长12 h后，加入终质量浓度分别为120、100、80、60、40 μg/mL的3-羟基根皮苷，分别培养24 h、48 h后，培养基中的葡萄糖经葡萄氧化酶作用，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将还原性4-氨基安替比林与酚偶联缩合成可测定的醌类化合物.通过测定OD值，根据[OD值(样品)/OD值(校准品)×5.5 mmol/L(校准液浓度)]/相对存活率=相对葡萄糖量(mmol/L)，计算相对葡萄糖量.

1.2.4 二型糖尿病小鼠模型建立

昆明小鼠48只，分成6组，每组各8只，以高糖高脂饮食联合低剂量腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ).STZ组织毒性较小、造模稳定、种属选择性不强.为降低模型死亡率，提高模型成模率，对小鼠进行少量多次STZ注射[9].柠檬酸盐缓冲液的配制：称量2.1 g柠檬酸(分析纯)，用超纯水定容至100 mL配制成A液；称量2.94 g柠檬酸二钠(分析纯)，用超纯水定容至100 mL配制成B液；按A∶B=1∶1(体积比)的比例混合，调整pH值至4.2～4.5之间，4℃保存备用.STZ易分解，应现用现配.

高脂高糖饲养4周后，STZ腹腔注射进行造模.诱导小鼠发生胰岛素抵抗.第5周，禁食12 h后，将STZ按照40 mg/kg的剂量溶于0.1 mmol/L的柠檬酸盐缓冲液(pH 4.2)中，对小鼠下腹部进行注射，分上下午注射两次，2 d后，观察饮食量、饮水量及血糖值，对血糖不达标的小鼠进行补充注射.

1.2.5 3-羟基根皮苷对小鼠糖耐量的影响

糖尿病小鼠48只，雌雄各半，分为空白组、模型组、阳性组、3-羟基根皮苷低中高剂量组及根皮苷低中高剂量组.正常昆明小鼠40只，雌雄各半，分为空白组、阳性对照组、3-羟基根皮苷低中高剂量组及根皮苷低中高剂量组.根据湖北省中药材质量标准，湖北海棠适用量2～5 g，湖北海棠中根皮苷含量约8.72%，根据体重及人与小鼠换算系数计算得到根皮苷剂量范围约30～80 mg/kg.3-羟基根皮苷剂量参考根皮苷分别为40、60和80 mg/kg.

隔夜禁食12 h，灌胃给药，空白组、模型组给予相等体积的双蒸水，阳性对照组给予二甲双胍(10 mg/kg)，测定血糖浓度，记做0 h血糖浓度，之后各组均给予葡萄糖溶液3 g/kg，每只小鼠0.4 mL，灌胃葡萄糖溶液30、60、120 min后尾静脉取血测各组的血糖，测定各组糖耐量.

1.2.6 3-羟基根皮苷对小鼠空腹、餐后血糖的影响

糖尿病小鼠及正常小鼠分组及灌胃剂量同上.空腹血糖测定：正常饲料喂养，灌胃给药后，禁食2 h、4 h，分别测定血糖含量.餐后血糖测定：禁食12 h，灌胃给药，再给予饲料喂养2 h，对餐后血糖进行测定.

1.2.7 3-羟基根皮苷对小鼠肝脏内G-6-Pase表达的影响

分别对空腹血糖、餐后血糖实验中的小鼠进行断脊椎处死，取肝组织，将肝组织用生理盐水洗净后，加入蛋白裂解液，在冰盒上充分研磨，待充分裂解后，通过BCA蛋白定量法检测蛋白浓度；进行SDS-PAGE凝胶电泳，条带经TBST洗3次后，5%脱脂奶粉于TBST溶液中溶解，进行封闭，封闭2 h后，洗条带3次，放入稀释好的一抗液，充分浸泡滤膜，室温孵育1 h后，4℃冰箱孵育过夜.用TBST溶液洗膜3次，每次10 min，用二抗稀释液充分浸泡滤膜，室温孵育1 h.将滤膜与显影试剂盒的试剂作用，进行显影.观察3-羟基根皮苷对小鼠空腹及餐后状态下G-6-Pase表达的影响.

1.2.8 统计学分析

2 结果与分析

2.1 胰岛素抵抗模型HepG2细胞的建立

由表1可知，在胰岛素浓度为10-6mol/L，作用48 h时，HepG2细胞生长状态良好，且出现胰岛素抵抗状态.

表1 不同浓度胰岛素作用24 h/48 h对HepG2细胞存活率及葡萄糖代谢的影响

2.2 3-羟基根皮苷对胰岛素抵抗模型HepG2细胞存活率的影响

由表2可知，24 h、48 h时，3-羟基根皮苷浓度100 μg/mL与模型组相比，差异无显著性(P>0.05).所以，3-羟基根皮苷浓度小于等于100 μg/mL时，对胰岛素抵抗模型HepG2细胞存活率没有影响，因此，3-羟基根皮苷实验浓度定为小于等于100 μg/mL.

表2 3-羟基根皮苷作用24 h/48 h对胰岛素抵抗模型HepG2细胞存活率的影响

2.3 3-羟基根皮苷对胰岛素抵抗模型HepG2细胞对葡萄糖摄取的影响

由表3可知，作用24 h、48 h时，3-羟基根皮苷各浓度与模型组相比，差异均具有显著性(P<0.05)，表明3--羟基根皮苷可改善胰岛素抵抗模型细胞HepG2的胰岛素抵抗状态，促进对外周葡萄糖的吸收.

表3 3-羟基根皮苷作用24 h/48 h对胰岛素抵抗模型HepG2细胞葡萄糖摄取的影响

2.4 二型糖尿病小鼠模型建立

模型组体重与空白组相比，差异具有显著性，同时对饮食和饮水量等观察，也出现多饮多食多尿的症状，符合二型糖尿病“三多一少”症状.通过对模型组空腹血糖测定，模型组空腹血糖值约为空白组2倍.说明二型糖尿病小鼠模型建立成功.

2.5 3-羟基根皮苷对小鼠糖耐量的影响

由表4可知，正常小鼠摄入葡萄糖后引起血糖升高，但2 h内血糖会恢复至空腹水平.给予葡萄糖0.5 h后各组血糖与0时血糖相比较均显著升高，但各给药组与空白组相比，血糖升高程度降低，差异有显著性(P<0.05，P<0.01)；给予葡萄糖1 h后，各组血糖开始降低，3-羟基根皮苷中、高剂量组与空白组相比，差异具有显著性(P<0.05，P<0.01)；给予葡萄糖2 h后，各组血糖继续降低，除阳性组与3-羟基根皮苷高剂量组外，各组与空白组相比，差异无显著性.由表5可知，糖尿病小鼠摄入葡萄糖后引起血糖升高，由于胰岛功能受损，糖耐受力受损，2 h血糖不能回复至空腹水平.小鼠给予葡萄糖0.5 h后各组血糖与0时血糖相比较均显著升高，但各组与模型组相比，血糖升高程度降低，差异有显著性(P<0.01)；给予葡萄糖1 h后，各组血糖开始降低，除3-羟基根皮苷低剂量组与模型组相比差异无显著性，其它组差异均具有显著性(P<0.01)；给予葡萄糖2 h后，各组血糖继续降低，除3-羟基根皮苷低剂量组外，各组与模型组相比，差异有显著性(P<0.05，P<0.01).糖耐量实验表明3-羟基根皮苷可增强正常小鼠和糖尿病小鼠的糖耐受力.

表4 3-羟基根皮苷对正常小鼠糖耐量的影响

表5 3-羟基根皮苷对糖尿病小鼠糖耐量的影响

2.6 3-羟基根皮苷对小鼠空腹血糖的影响

由表6可知，与空白组相比，禁食2 h后，除3-羟基根皮苷低剂量组外，其它各组与空白组相比，血糖升高，差异具有显著性(P<0.01)；禁食4 h后，各剂量组血糖升高，3-羟基根皮苷高剂量组血糖与空白组相比，差异具有显著性(P<0.01)，其它各组与空白组相比，差异无显著性.与空白组相比，餐后2 h后，3-羟基根皮苷高剂量和阳性药组与空白组相比，血糖明显降低，差异具有显著性(P<0.01)，其它各组与空白组相比，血糖值有降低，但差异无显著性.表明3-羟基根皮苷对正常小鼠具有升高空腹血糖，降低餐后血糖的作用，高剂量作用显著.

表6 3-羟基根皮苷对正常小鼠空腹及餐后血糖的影响 (单位：mmol/L)

由表7可知，与空白组相比，禁食2 h后，各组与模型组相比，差异具有显著性(P<0.01)；禁食4 h后，各剂量组血糖逐渐降低，模型组与其它组相比，差异仍具有显著性(P<0.05，P<0.01)，给药组血糖已逐渐接近空白组血糖.与空白组相比，餐后2 h后，3-羟基根皮苷高剂量和阳性药组与模型组相比，血糖明显降低，差异具有显著性(P<0.05，P<0.01).表明3-羟基根皮苷各剂量均能降低糖尿病小鼠空腹血糖和餐后血糖，且高剂量作用显著.

表7 3-羟基根皮苷对糖尿病小鼠空腹及餐后血糖的影响 (单位：mmol/L)

2.7 3-羟基根皮苷对小鼠肝脏中G-6-Pase表达的影响

2.7.1 3-羟基根皮苷对空腹小鼠肝脏中G-6-Pase表达的影响

由图1可知，在正常小鼠空腹状态下，血糖水平相对较低时，3-羟基根皮苷各剂量组与空白组相比，增加G-6-Pase的表达，差异具有显著性(P<0.01).由图2可知，在糖尿病小鼠空腹状态下，血糖水平仍高于正常水平，3-羟基根皮苷中、高剂量组与模型组相比均抑制G-6-Pase的表达，差异具有显著性(P<0.01).结果表明，3-羟基根皮苷对不同血糖值下，对G-6-Pase存在双向调节的作用.

图1 3-羟基根皮苷对正常小鼠空腹时肝脏中G-6-Pase表达的影响

图2 3-羟基根皮苷对糖尿病空腹时肝脏中G-6-Pase表达的影响

2.7.2 3-羟基根皮苷对餐后小鼠肝脏中G-6-Pase表达的影响

由图3和图4可知，正常小鼠及糖尿病小鼠餐后状态下，血糖水平较高，3-羟基根皮苷各剂量组均抑制G-6-Pase的表达，差异具有显著性(P<0.01).结果表明，3-羟基根皮苷可以降低餐后状态下G-6-Pase的表达.图4中，糖尿病小鼠低剂量时G-6-Pase表达量低于中剂量，可能与高血糖水平有关.

图3 3-羟基根皮苷对正常小鼠餐后肝脏中G-6-Pase表达的影响

图4 3-羟基根皮苷对糖尿病小鼠餐后肝脏中G-6-Pase表达的影响

3 讨 论

通过体内外实验发现，3-羟基根皮苷可以改善胰岛素抵抗状态，增加对葡萄糖摄取，降低血糖，调节糖异生关键酶G-6-Pase，稳定血糖，对糖尿病防治具有积极作用.

血糖波动带来的危害比血糖绝对值偏高更大[10]，研究发现3-羟基根皮苷不仅具有降低血糖的作用，还可以稳定血糖，减少血糖波动.因此，3-羟基根皮苷具有良好的研究利用潜力.餐后、餐前血糖通常是一天血糖中的高峰低谷，尤其对于糖尿病前期或糖尿病患者，胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗，不能有效促进组织细胞对葡萄糖的摄取和利用，使得体内糖脂代谢紊乱[11].本实验中，分别对正常小鼠和糖尿病小鼠的空腹血糖及餐后血糖进行测定，结果表明，3-羟基根皮苷对小鼠餐后血糖升高均具有降低的作用，但对不同健康状况小鼠的空腹血糖调控，出现了不同结果，糖尿病小鼠的空腹血糖值高于正常水平，3-羟基根皮苷降低其血糖水平，正常小鼠的空腹血糖值低，3-羟基根皮苷升高其血糖水平，具有稳定血糖的作用.其作用与双向调控糖异生关键酶G-6-Pase有关.G-6-Pase是糖异生过程中关键酶，决定糖异生的关键环节，肝糖原经糖原磷酸化酶催化降解为葡萄糖-1-磷酸(glucose-1-P)，再经变位酶作用生成葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-P)，最后在葡萄糖-6-磷酸酶的作用下脱去磷酸而输出葡萄糖，一定程度上维持血糖平衡[12].3-羟基根皮苷对正常小鼠及糖尿病小鼠餐后G-6-Pase表达具有抑制作用；对糖尿病小鼠空腹高血糖时，抑制G-6-Pase的表达，而对正常小鼠空腹低血糖时增强G-6-Pase的表达，与血糖测定结果趋势一致.综上所述，3-羟基根皮苷不仅具有降低血糖的作用，还可以起到稳定血糖、减少血糖波动的作用，其机制与3-羟基根皮苷可以双向调节糖异生关键酶G-6-Pase表达有关.

海棠茶是土家族饮茶，也是湖北、湖南、重庆等地习用的餐饮茶，习称化红茶，具有悠久的饮用历史.海棠茶中根皮苷[13]及3-羟基根皮苷等成分共同作用，既有助于降低糖尿病人血糖，又有助于稳定正常和糖尿病人血糖，避免低血糖的发生，还可延缓胰岛素功能受损.同时海棠茶还可调节脂质代谢，是品质优秀的餐饮茶，值得进一步推广利用.