烟草病害的相关检测技术进展

摘要：近年来，烟草病害发生十分普遍，且危害较大，给烟叶生产带来了巨大损失。因此，建立各种烟草病害的检测鉴定方法十分必要。本文论述了主要烟草病害的检测鉴定方法，包括病毒病、青枯病和赤星病。

关键词：烟草病害;病毒病;青枯病;赤星病

烟草原产于美洲，于17世纪初传入我国，已有近400年的种植历史。随着全球环境气候的变化，烟草病害也日益严重，给烟叶生产及烟农造成了经济损失。例如，20世纪80年代，烟草病毒病在全国范围内大流行，导致全国烟叶严重减产，造成巨大经济损失。在我国，发生较为广泛的烟草病害主要包括烟草病毒病、赤星病以及青枯病等。为了科学防治烟草病害，降低其对烟草生产的危害，建立起具有针对性的检测方法，在烟草病害发生的早期及时进行鉴别，将为科学制定防治策略提供依据，并将有助于研究病害生物的流行病学规律。

1  烟草病毒病的检测

我国烟叶生产上常见的烟草病毒病有20余种，其中烟草普通花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒造成的危害最为严重。由于烟草病毒缺乏细胞结构、形态极其微小，只能在活细胞中增殖。因此，烟草病毒鉴定专业性强、操作难度大，对人员、设备的要求高。随着生物技术的发展，现普遍采用的烟草病毒检测方法有扫描电镜检测技术、免疫学检测法和分子生物学检测方法。

1.1  电镜检测方法

1939年，德国科学家首次通过电镜观察到烟草花叶病毒并拍下照片，从此以后，电镜成为研究植物病毒的通用方法，该方法通过运用负染色技术、免疫吸附技术、超薄切片技术以及扫描电子显微镜技术，能够通过形态观察，直观、准确地鉴别烟草病毒，是一种简单、灵敏的病毒检测方法，能够区分病毒的种类甚至株系。根据文献报道，黄遵锡等通过电镜观察到PVY、TMV、TEV、PVX等烟草病毒的病毒粒体，以及粒体上的套环结构。但是该方法的缺陷是不仅电镜设备昂贵，而且病毒样本的制片以及电镜的操作较为复杂，无法分辨球状病毒。此外，植物破碎细胞器容易对电镜检测结果产生干扰，从而影响结果。

1.2  免疫学检测方法

免疫学检测方法是利用抗原抗体特异性结合的检测方法，是国内外检测植物病毒的主流方法之一，具有操作简单、自动化程度高的特点，主要包括酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫胶体金检测法、免疫毛细管区带电泳检测法和免疫 PCR检测法。黄遵锡等人利用免疫学检测方法成功鉴定了PVX、PVY、TMV、TEV、CMV等烟草病毒。该方法的局限在于无法检测抗原性较差的病毒、RNA病毒以及类病毒;灵敏性较低，无法检出含量较低的病毒，容易发生漏检。

1.3  分子生物学检测方法

分子生物学在21世纪得到了较大的发展，可用于烟草病毒检测的方法有核酸分子杂交技术、PCR技术、dsRNA技术、siRNA高通量测序技术等。核酸分子杂交，又称为探针检测技术，是通过碱基互补配对形成稳定的双链的过程，两条链是使用的探针及待测核酸序列，核酸分子杂交主要包括Southern杂交、Northern杂交以及点杂交。聚合酶链式反应（PCR）技术检测植物病毒，是通过扩增植物病毒基因组，再分析扩增产物的方法，具有特异性强、结果准确、灵敏度高等优点。基于PCR技术，又衍生出了逆转录PCR、免疫捕捉逆转录PCR以及实时荧光定量逆转录PCR等方法。dsRNA电泳技术是从植物病毒中提取得到dsRNA，通过电泳得到电泳图谱，利用图谱鉴别病毒种类。siRNA高通量测序技术，是通过利用测序技术对烟草的小RNA进行高通量测序，再利用生物信息学方法进行比对，从而鉴别烟草病毒的方法。

2  烟草青枯病的检测

烟草青枯病的病原体是劳尔氏菌属假单胞杆菌，它是一种以植烟土壤为传播媒介的病原菌，在适宜的土壤环境中，这种病菌可以在土壤中较长时间的存活，甚至可以存活整個冬天。一般情况下，植烟土壤中青枯病原菌越多，烟叶病害也就相对越严重。因此，有必要建立起分离纯化和检测土壤中青枯病原菌数量的方法。目前青枯病原菌的检测方法包括有常规方法、指示植物法、免疫学法以及分子生物学法等4种。常规方法是根据青枯病菌所需要的一种或者几种特殊营养物质，通过半选择培养基和稀释平板法分离出青枯病原菌，然后在培养基中对其菌落形态、颜色等生理特征进行观察，以此鉴定病原菌。指示植物法是鉴别青枯病菌的另一种传统方法，是在含有目标病原菌的土壤中种植指示植物，通过观察指示植物感染后的症状，从而判断是否有病原菌的存在。常规方法、指示植物法都因检测周期较长，应用比较少。免疫学检测法（ELISA）是利用抗体与青枯病菌细胞的抗原结合，发生特异反应，来区别于其它微生物，该方法反应灵敏、操作简单，但免疫学法受抗体质量限制。分子生物学法主要是使用核酸分子杂交技术和聚合酶链式反应技术，是当前测定青枯病原菌的主要方法，具有灵敏度高、特异性强的特点。

3  烟草赤星病的检测

赤星病是烟草生产中后期发生的叶斑病，对烟叶产量和质量影响都很大。与青枯病菌不同，烟草赤星病是由链格孢菌侵犯所引起的。链格孢菌是一种真菌，菌丝无色透明，菌丝进入来年春季后长出分生孢子，这些无色的孢子将成为烟草的初侵染源。自1892年赤星病首次由Ellis和Everhart报道以来，曾几次成为世界烟叶生产的严重病害。20世纪60年代，赤星病在山东、河南等烟区猖獗为害。目前，赤星病菌的检测鉴定方法以形态学、生理学以及细胞学等为依据，主要以产孢表型、分生孢子等形态学指标为主要依据，通过PCR技术，结合多基因位点序列进行检测。此外，马贵龙等利用ELISA间接法成功对烟草种子上是否带有赤星病菌进行了鉴定，表明免疫学法可以用于快速检测赤星病菌。

4  结论与展望

目前，研究人员探索了一系列检测烟草病毒的方法，电镜检测法更为直观，可直接观察到病毒的结构和形态;免疫学检测法操作简单，速度快;分子生物学法反应灵敏、特异性强;具体使用哪种方法需要根据检测成本、检测目的等因素而定。烟草青枯病常使用免疫学检测法、分子生物学法进行检测鉴定。而烟草赤星病目前主要利用常规方法和基因测序相结合的方法。此外，免疫学检测法也可用于烟草赤星病菌的检测。随着技术的进步，越来越多的现代分析测试技术将用于烟草病毒的检测，为烟草病害的防治提供及时可靠的依据。

作者简介：张朝（1987-），男，硕士，中级工程师。研究方向：烟草植保技术。