Cu2+对马来眼子菜形态解剖特征及细胞超微结构的影响

高桂青，江 延，王 岩，贾雨淅，李睿江，杨婉秋，盛 敬

(南昌工程学院 1.土木与建筑工程学院；2.水利与生态工程学院；3.机械与电气工程学院，江西 南昌 330099)

近年来，重金属水污染问题在全世界范围内得到了广泛的关注，其中以铜、镉、铅和铬等尤为严重[1]，这一现象已经严重影响到水生生物多样性[2-4]。研究表明，重金属浓度超过一定范围时，会对水生植物的生长产生巨大影响[5-6]，严重时甚至导致植物停止生长[7]。铜虽然是植物所需的微量元素之一[8]，但是过量的铜会减轻植物光合作用的能力，并对植物的叶绿体、细胞壁等细胞器造成一定的损伤[9-10]。目前，大量针对沉水植物的研究主要集中于植物对重金属的富集和生理生化的响应[11-12]，对植物形态特征和超微结构的研究也日益成熟。

马来眼子菜是我国一种常见的水生植物，主要分布在长江中、下游湖泊。随着以种植沉水植物来治理重金属污染的方法被越来越广泛地使用，马来眼子菜已经成为重金属污染的首选修复植物之一[13-14]。本文就马来眼子菜受不同浓度Cu2+胁迫后形态解剖特征和细胞超微结构的响应进行探讨，为马来眼子菜在重金属污染水体修复的应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用马来眼子菜和底泥均采自鄱阳湖。马来眼子菜选取长势相近，无分支的顶端(叶长18±0.5 cm，4个叶片)，将表面附着物洗去。清理底泥中的杂物并混匀置于塑料小盒(长20 cm，宽13 cm，高8 cm)中，底泥厚度为6 cm，每盒种植6株植株，然后将塑料小盒置于白色圆桶(直径44 cm，高70 cm)内加水至68cm处进行预培养。两周后向圆桶中加入不同浓度的CuSO4溶液，地表水环境质量标准(GB3838—2002)中V类水Cu2+浓度为1.0mg/L，此试验中控制Cu2+浓度分别为0.5 mg/L，1.0 mg/L，2.0 mg/L，3.0 mg/L和4.0 mg/L。与此同时，设置一组浓度为0 mg/L的空白对照组。胁迫培养7 d后，用于马来眼子菜形态特征和超微结构观察。

1.2 试验方法

形态特征观察：于各处理组织相同高度马来眼子菜叶片的叶脉与叶片边缘之间切取2 mm2左右小块，取材后用FAA固定液(50%乙醇：冰醋酸：甲醛=18∶1∶1)进行固定，通过一系列乙醇和二甲苯脱水、透明、包埋后进行番红—固绿双重染色，最终用中性树脂封片，制成永久切片。将切片置于Olympus BH-2光学显微镜下观察和拍照。

超微结构观察：于各处理组相同高度马来眼子菜叶片的叶脉与叶片边缘之间切取2mm2左右的小块，用3%戊二醛固定，1%四氧化锇再固定。经乙醇脱水，丙酮过渡后，用环氧树脂包埋，超薄切片机上切片，切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后置于H7650型透射电子显微镜下观察和拍照。

2 结果与分析

2.1 Cu2+对马来眼子菜形态解剖结构的影响

从图1(a)中可以看出，马来眼子菜叶片厚度相对较薄，整体叶片呈长条状。叶片表面由表皮细胞紧密排列组成。表皮细胞体积相差不大，形状为圆润的方形。上表皮的细胞体积略大于下表皮细胞。上、下表皮排列整齐，导致马来眼子菜的表面平整光滑。上、下表皮细胞之间主要排列着叶肉组织，由薄壁细胞组成。薄壁细胞形状大小各不相同，但彼此之间隔膜相当明显。结构中仅有少量的气室存在，所以马来眼子菜通气组织不发达。叶片中发现叶脉的存在，叶片维管束导管较小，导管彼此之间排列紧密。小导管数量较多，位置处于中央，较大的导管数量很少，分布在四周。没有发现栅栏组织和海绵组织的分化。

当胁迫浓度为0.5mg/L时，马来眼子菜的整体结构没有发生显著的变化，如图1(b)所示。说明其对低浓度重金属有一定的耐受性。但当Cu2+浓度为1.0mg/L时，部分叶肉组织出现一定程度的皱缩现象，如图1(c)所示。薄壁细胞的排列也开始变得混乱，形状也开始变形，如图1(d)所示。当胁迫浓度达到2.0mg/L时，薄壁细胞之间的挤压更加紧密，如图1(e)所示。当Cu2+浓度上升到3.0mg/L后，叶片相较于对照组厚度非常薄。叶脉组织所占的体积变小。叶片的表面也变得不再平整光滑。下表皮细胞的排列甚至出现了错位的现象，如图1(f)所示。当胁迫浓度达到4.0mg/L时，叶脉组织的小导管完全挤压在一起，叶片内部的物质交换受到严重阻碍。靠近叶脉组织的部分薄壁细胞变形严重，整个叶片结构呈现以叶脉为支点向上拱起的趋势，如图1(g)所示。受损严重的部位出现叶片长条状结构断裂的现象，如图1(h)所示。

图1 不同浓度Cu2+对马来眼子菜形态解剖结构的影响

2.2 Cu2+对马来眼子菜叶片超微结构的影响

从叶片整体上看，马来眼子菜在未受到Cu2+胁迫情况下，叶绿体贴着细胞壁紧密分布，其形状近似为长椭圆形。而线粒体分布在叶绿体四周，形状为球形如图2(a)所示，且数量较多。Cu2+浓度为0.5mg/L时，除叶绿体出现略微的变形外，细胞整体结构变化不大，如图2(b)所示。当Cu2+浓度为1.0mg/L时，叶绿体变形较严重，其内部还有少量体积较小的淀粉粒生成，细胞壁的颜色也开始变暗，如图2(c)所示。当Cu2+浓度为2.0mg/L时，叶绿体外膜开始损坏，已经不能维持原本的形状，内部淀粉粒体积也开始变大，如图2(d)所示。当胁迫浓度达到3.0mg/L时，部分细胞壁出现扭曲的现象，边缘部分颜色变黑。叶绿体膜被破坏，各叶绿体之间逐渐连成一片，内部淀粉粒的体积也明显增大，如图2(e)所示。而在浓度为4.0mg/L的情况下，沿细胞壁分布的叶绿体已经完全连在一起。细胞壁厚度也变得很薄，形状完全扭曲，如图2(f)所示。此时，整个细胞受毒害情况十分严重。

图2 不同浓度Cu2+对马来眼子菜叶片超微结构的影响

2.3 Cu2+对马来眼子菜叶绿体超微结构的影响

叶绿体受Cu2+胁迫的变化相当明显。正常情况下，马来眼子菜的叶绿体呈长椭圆形。内部类囊体基粒和片层排列整齐且十分紧凑，垛叠程度较大，如图3(a)所示。由于受到浓度为0.5mg/L的Cu2+胁迫，叶绿体产生轻微的变形，但整体结构并未发生显著变化，如图3(b)所示。随着Cu2+浓度的升高，叶绿体产生了两种不同的变化。部分叶绿体开始变得弯曲或膨大，其内部还伴随着淀粉粒的生成，如图3(c)所示。其余的叶绿体体积膨胀，内部类囊体排列发生紊乱，形状变圆，如图3(d)所示。当胁迫浓度为2.0mg/L时，叶绿体内部的淀粉粒数量增多，体积增大。说明此时Cu2+对叶绿体内部的物质运输已经造成了严重的干扰，如图3(e)所示。当Cu2+浓度为3.0mg/L时，叶绿体外膜已经遭到了破坏，其内部还出现了大量的脂质小球，如图3(f)所示。说明其中的类囊体已经开始降解，细胞器开始呈现出衰老或病态。有些叶绿体已经完全变形，淀粉粒已经占据了叶绿体的大部分体积，如图3(g)所示。而Cu2+浓度为4.0mg/L时，叶绿体的被膜完全被破坏，造成大量的类囊体残缺，剩余的类囊体基质紊乱不堪，垛叠程度很小，呈现十分松散的状态。叶绿体开始解体，如图3(h)所示。

图3 不同浓度Cu2+对马来眼子菜叶绿体的影响

2.4 Cu2+对马来眼子菜细胞壁超微结构的影响

马来眼子菜细胞壁的变化相对叶绿体较小。未受胁迫情况下，细胞壁厚度均匀，颜色较浅，形状很规律，如图4(a)所示。浓度为0.5mg/L时细胞壁无明显变化，如图4(b)所示。当浓度升高到1.0mg/L时，细胞壁仅颜色略微变深，但仍未发现显著的变化，如图4(c)所示，说明马来眼子菜细胞壁的耐受性大于叶绿体。当Cu2+浓度升高至2.0mg/L时，细胞壁的边缘部分明显变暗，如图4(d)所示，其内部甚至发现部分破损，并且这一现象还随着Cu2+浓度的升高愈发严重，如图4(e)所示。而当Cu2+浓度为4.0mg/L时，细胞壁的厚度明显变薄，整个细胞壁呈现一种波浪式的形状，并且开始有质壁分离的现象出现，如图4(f)所示。

图4 不同浓度Cu2+对马来眼子菜细胞壁的影响

3 讨论

植物叶片是抵抗太阳辐射保护叶片结构的重要屏障[15]。马来眼子菜为多年生沉水植物，其叶片细长柔软较薄，这种叶片结构能够增加马来眼子菜叶片的浮力，有利于植物叶片向水体上层生长[16]，同时适应水流的波动[17]。叶片内部上、下表皮细胞相对较厚，且上表皮细胞大于下表皮细胞，其原因可能是马来眼子菜上叶面要抵抗太阳辐射以保护叶片内部结构，而下叶面背光[18]。受各浓度梯度Cu2+胁迫，上下表皮细胞出现不同程度的变形，且表皮细胞有逐渐向中间部位挤压的趋势，叶片厚度变薄，这与陈小峰[16]等对菹草叶结构研究的结论相吻合。马来眼子菜上、下表皮细胞排列紧密，大小相当，所以表面平整光滑。由于受到重金属的毒害，表皮细胞排列变得扭曲，体积大小发生变化，叶片的结构表面也变得凹凸不平。

处于表皮细胞中间的是叶肉组织和叶脉组织。叶肉组织由一到两层薄壁细胞组成，没有发现海绵组织和栅栏组织的分化。薄壁细胞彼此之间排列紧密，表面圆润光滑，所以能够保证植物叶片能量的传递和物质的交换[19]。马来眼子菜通气系统不发达，所以其气体来源主要是水中溶解气体和气腔中的气体[20]，而眼子菜叶片的气体交换主要依靠薄壁细胞之间的间隙渗透进行，这种结构比栅栏组织更有利于植物叶片的气体交换[21]。受Cu2+的影响，薄壁细胞形状发生变化，原本圆润的细胞隔膜变得不规则。薄壁细胞彼此之间更加紧密，单双层结构也变成多层排列分布。这种形态的变化不利于细胞间能量的传递，因此Cu2+的胁迫能够对马来眼子菜叶片内部的物质交换产生一定的影响[22]。当Cu2+达到2.0mg/L时，结构中观察到气腔体积增大的现象。有报道称重金属的胁迫能够破坏了薄壁细胞的外层隔膜，形成更加发达的通气组织。并且，由于叶片内部有新的气室产生，增加了叶片本身的浮力，能够促进植物向上生长，使其叶片能够漂浮水中以增加叶片受光面积，进而增强叶片光合作用[20]。这是植物本身对抗逆境的一种表现形式。

叶脉在植物叶片结构中扮演着重要的角色，叶脉的存在既能增强叶片的机械性能，同时也为植物叶片的气体运输提供途径[23]。马来眼子菜维管束不是特别发达，且结构非常简单，由多数小导管组成，中脉相对清晰，但细胞体积很小，相比薄壁细胞排列更加密集。维管束的内部是初生木质部[24]，是由一些小型导管构成。由于细胞排列十分密集，所以无法区分初生木质部和原生木质部。其外测是初生韧皮部，为维管束的主体结构[25]。叶脉组织在受到低浓度Cu2+的胁迫下所发生的变化不大，但当Cu2+浓度达到3.0mg/L时，整个叶脉组织体积明显减小，维管束向内部收缩。细胞排列更加紧密且体积变得更小，对马来眼子菜的气体输送起到了阻碍作用[26]。整体上看，马来眼子菜叶脉组织受重金属胁迫的影响较表皮细胞和叶肉组织小，说明叶脉的抗重金属能力比表皮细胞和叶肉组织强[14]。

Cu2+对马来眼子菜超微结构的影响是多方面的，植物叶片能够通过改变自身形态和结构来适应外界环境的改变[27]，但外界环境胁迫能导致叶片细胞生理功能的降低[28-29]。其中叶绿体和细胞壁对Cu2+的响应尤为显著，且叶绿体对Cu2+的敏感性高于细胞壁。而线粒体对重金属的耐受性相对较高，原因可能是植物体要依靠线粒体呼吸作用来抵抗重金属对其本身所造成的伤害[30]。叶绿体是植物进行光合作用最重要的细胞器，健康的叶绿体是保障植物能够正常生长发育的基本条件。部分学者认为叶绿体也是植物受外界压力影响最直接的细胞器[31]。本实验中，Cu2+浓度较高的植物样品中存在马来眼子菜叶片失绿的现象，说明重金属的胁迫能够造成细胞叶绿素含量下降[32]。这种变化也能反映植物受重金属毒害的程度，影响到叶绿体光合作用的进行。有研究报道叶绿体内部类囊体的垛叠程度能够代表叶绿素含量和叶绿素(a/b)的比值变化[33-34]。本研究中随Cu2+浓度的升高，马来眼子菜叶绿体内部类囊体垛叠程度逐渐变小，说明植物叶片光抑制加强，造成光合作用效率下降[35-36]。叶绿体形状受Cu2+的胁迫有两种变化趋势。部分叶绿体形状变得弯曲或膨大，Cu2+浓度为1.0mg/L时内部还有淀粉粒生成，而淀粉粒是由于光合作用合成的糖类运输受到阻碍聚集形成[37]，说明此时叶绿体的物质运输已经受到了影响。随着Cu2+浓度的升高，淀粉粒的数量逐渐增多，体积也会逐渐增大，严重时甚至能导致物质运输功能完全瘫痪；还有些叶绿体在重金属的胁迫下会逐渐扩张成球形，目的是通过增大叶绿体表面积来增强太阳光线的直接穿透和受光面积，进一步加强光合效率，从而减轻高浓度Cu2+造成的伤害[38]。Cu2+的胁迫还会造成类囊体的降解，降解产物的脂质部分集结形成脂质小球[39]。低浓度Cu2+胁迫中，脂质小球的数量较少，但也预示着叶绿体开始衰老或出现病理变化[38]。Cu2+浓度越高，脂质球体的数量越多，体积越大，叶绿体所受毒害也越严重。因此，很多人把脂质球体的变化作为判断植物叶片受损程度的标志[40]。

细胞壁是保护细胞内部结构的重要屏障。本实验中，马来眼子菜细胞壁对Cu2+的耐受性较叶绿体高，说明低浓度的重金属对细胞壁产生的影响相对较小。未受Cu2+胁迫时，马来眼子菜细胞壁厚度均匀，形状规则，颜色较浅。随着Cu2+浓度的加大，细胞壁逐渐变形，高浓度Cu2+胁迫中，细胞壁呈现出波浪式的变形。另外，在浓度为2.0mg/L时，细胞壁的边缘明显变暗，可能是细胞分泌一种特殊的物质，能够包裹进入的Cu2+形成黑色沉淀并附着在细胞壁附近[41]。

4 结束语

马来眼子菜对低浓度Cu2+具有一定的耐受性，能够保证其正常的生长发育。但当Cu2+浓度较高时，会对马来眼子菜的形态结构和超微结构造成严重的影响。其中，叶片叶肉组织和细胞叶绿体、细胞壁受重金属毒害较为明显。因此，叶片叶肉组织、叶绿体和细胞壁这3种结构的变化能够作为马来眼子菜受重金属胁迫响应研究的理想探针。