黄土高原旱作麦田土壤真菌多样性对长期保护性耕作的响应*

吕贝贝, 张丽萍, 张贵云, 刘 珍, 范巧兰, 姚 众, 常芳娟

(山西农业大学棉花研究所 运城 044000)

土壤微生物作为陆地生态系统的关键组分[1],在介导土壤有机质分解和养分循环方面发挥着核心作用, 对决定土壤质量、农业和生态系统可持续性至关重要[2]。已有研究表明, 耕作方式在影响土壤参数、土壤微生物群落结构以及微生物生物量等方面起重要作用[3-4]。真菌是土壤环境中的重要分解者,参与分解和循环土壤有机质和矿物质营养成分, 包括木质素、纤维素、碳、氮等[5]。耕作可以通过破坏土壤团聚体和菌丝体网络, 改变植物残体降解能力, 并改变土壤微气候, 在很大程度上影响土壤真菌群落结构[6]。

保护性耕作是一项旱地耕作技术, 可通过秸秆覆盖、免耕或少耕等方式, 将作物残茬和有机物质留在土壤表面, 以保护土壤免受板结和侵蚀[7-8]。而传统耕作会对上层土壤造成物理破坏, 从而形成物理特性和养分分布相对一致的均匀土层[3]。在我国北方旱作区, 采用保护性耕作技术替代传统耕作,能够减少土壤扰动, 改善土壤结构和稳定性, 提高土壤肥力和持水能力, 增加土壤微生物活性和多样性[9-12]。近年来, 有关土壤微生物对耕作方式响应的研究受到了广泛关注, 国内外有关保护性耕作对土壤微生物群落结构和多样性的影响已有诸多研究。我们在前期的研究结果[13]也表明, 长期保护性耕作,尤其是免耕与深松作业相结合的保护性耕作方式,促进了土壤丛枝菌根真菌(AMF)向土壤深层发展,提高了土壤AMF的多样性。但是长期采用保护性耕作措施并非总是产生正效应。马璐璐等[14]研究发现,玉米(Zea mays)秸秆连年还田会引起小麦茎基腐病日益加重。Wang等[15]研究发现, 相比传统耕作, 免耕秸秆覆盖显著提高了土壤真菌的丰富度, 显著增加了两种病原菌[禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)]的丰度,说明长期保护性耕作可能会增加中国东北地区玉米根腐病的发生风险。保护性耕作现已在全球农业生产中大力推广和应用[16], 随之而来的经济和环境效益也越来越显著[17]。但是不同地区土壤真菌群落的变化并不完全一致, 对耕作方式的响应尚有争议[18],所产生的影响是正向还是负向并未明确。因此, 目前尚不清楚保护性耕作如何以及是否有助于可持续农业, 考虑到保护性耕作对于杂草和病虫害控制的潜在负面影响[19], 为更好地了解黄土高原旱作麦田农业实践对土壤生态系统的影响, 以及长期保护性耕作介导土壤微生物群落的机制, 本研究采用高通量测序方法, 监测黄土高原旱作麦田不同耕作方式下土壤真菌群落结构的变化, 以期为选择并建立合理的保护性耕作制度提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

本研究于2019年在山西省临汾市尧都区城隍村(36°01′N, 111°37′E, 海拔555 m)进行, 所依托的保护性耕作体系长期定位试验始于1992年。该区域属黄土高原, 年均气温12.2 ℃, 0 ℃以上积温4600 ℃, 无霜期195 d, 年均地温13.8 ℃。年均降水量515.7 mm, 且均集中在7—9月份; 年均蒸发量1933.1 mm。试验区土壤为碳酸盐褐土, 种植制度为长期单一种植冬小麦(Triticum aestivum)。试验区无灌溉条件, 作物生长依靠自然降水。试验期间平均气温较常年偏高1.2 ℃, 降水量偏少44.0 mm。

1.2 试验设计

试验依托长达27年(始于1992年)的保护性耕作试验平台, 选择传统耕作(TT1)、免耕覆盖(NTS)、连续深松覆盖4年后免耕覆盖(SNTS) 3种耕作处理方式(表1)。每个处理3次重复, 小区面积为600 m2。供试小麦品种为‘长6359’, 播种量120 kg·hm-2, 2018年9月23日播种。试验田化肥使用量尿素为225 kg·hm-2, 磷酸二铵为150 kg·hm-2。

表1 不同耕作处理方式描述Table 1 Description of different tillage treatments

1.3 土样采集与测定分析

于2019年5月6日(小麦灌浆期)采集小麦根围土样。每小区五点法取样, 去掉表土, 用土钻从0～20 cm土层采集小麦根部周围0～5 cm范围土壤,每点采集3份土样, 除去砂石、根系等杂物, 混匀后装入10 mL塑料离心管中, 低温条件下带回实验室,保存于-80 ℃冰箱中, 用于分析土壤真菌群落结构。

土壤总DNA的提取及PCR扩增: 土壤微生物基因组总DNA的提取采用试剂盒进行。采用引物ITS5-1737F (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2-2043R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)对土壤真菌ITS1区rRNA基因进行扩增。30 μL PCR反应体系: Phusion Master Mix (New England Biolabs, 2×) 15 μL, Primer (2 μmol·L-1) 3 μL, Genomic DNA (1 ng·μL-1) 10 μL, dd H2O 2 μL。PCR反应条件为: 98 ℃ 1 min; 98 ℃ 10 s, 50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s, 共30个循环; 72 ℃ 5 min。每个样本重复3次, PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测, 对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建,构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量, 文库合格后, 使用Illumina公司的HiSeq 2500进行上机测序。土壤真菌总DNA的提取及测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.4 生信和统计学分析

测序得到的原始数据经过拼接、质控、嵌合体过滤, 得到有效序列, 将相似度≥97%的有效序列进行OTU聚类, 采用软件RDP classifier对序列进行分类注释。使用R语言绘制样品物种组成Venn图、相对丰度柱状图和聚类热图。以Unweighted Unifrac距离矩阵构建UPGMA(非加权组平均法, unweighted pair-group method with arithmetic means)样品聚类树并将聚类结果与各样品在门水平上的物种相对丰度整合。选用LEfSe统计分析方法对样本间真菌多样性差异进行显著性检验。使用QIIME软件分析样品的Alpha多样性, 计算真菌的Chao1、ACE、Shannon、Simpson、PD_whole_tree、Good’s-coverage等。采用WPS表格整理数据, SPSS 20.0进行单因素方差分析, 并用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同耕作方式土壤真菌物种组成

如图1A所示, 不同耕作方式对土壤真菌OTU有明显影响。3个处理共产生2161个OTU, 其中共有的677个, 占总OTU数量的31.33%。TT1、NTS和SNTS分别具有1200、1416和1432个OTU。SNTS独有的OTU最多, TT1独有的OTU最少。TT1和SNTS共有的OTU最少(804个), NTS和SNTS共有的OTU最多(949个)。结果表明, 3个处理真菌物种组成存在差异,免耕和深松免耕增加了土壤真菌类群。

由图1B可知, 3个处理检测出的真菌门主要包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和球囊菌门(Glomeromycota)。NTS处理检测出了分类地位不确定真菌。其中, 子囊菌门(58.02%～71.03%)、担子菌门(19.34%～33.02%)、接合菌门(7.64%～15.92%)为优势菌门, 均为常见门类。与TT1相比, NTS和SNTS子囊菌门、接合菌门、壶菌门和球囊菌门真菌相对丰度增加, 担子菌门相对丰度减少。

属水平上, 选取不同耕作处理丰度排名前35的真菌属绘制热图(图2)。由图2可知, TT1中端梗孢属(Acrophialophora, 10.46%)和被孢霉属(Mortierella,3.88%)为优势属, NTS中赤霉菌属(Gibberella, 5.60%)和镰刀菌属(Fusarium, 3.38%)为优势属, SNTS中漆斑菌属(Myrothecium, 8.06%)和赤霉菌属(7.64%)为优势属。与TT1相比, NTS和SNTS导致漆斑菌属、赤霉菌属、圆盘菌属(Orbilia)、核腔菌属(Pyrenophora)、枝孢属(Cladosporium)、镰刀菌属、花冠菌属(Corollospora)、链格孢属(Alternaria)相对丰度增加, 端梗孢属、被孢霉属相对丰度减少。

对3个处理的土壤真菌相似性进行UPGMA聚类分析(图3)。由图3可知, 不同耕作处理真菌群落组成可分为两大类, NTS和SNTS处理在聚类关系上具有高度趋同性, 表明NTS和SNTS群落组成最接近。

2.2 不同耕作方式土壤真菌群落的多样性分析

LEfSe分析中, 选择LDA Score大于3.5的差异物种进行柱状图展示(图4A), 柱状图的长度代表差异显著物种的影响大小。由图4A可知, TT1中具有显著差异的关键优势物种(即Biomarker)分别为1个纲、1个目、1个科, 均属担子菌门。NTS中的Biomarker是1个种, 属子囊菌门。SNTS中的Biomarker是1个科, 也属子囊菌门。在图4B进化分支图中, 小圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比,黄色代表无显著差异的物种, 有显著差异的物种跟随处理进行着色, 红色、绿色、蓝色节点分别代表在NTS、SNTS、TT1中起到重要作用的微生物类群。由图4B可知, 担子菌门的银耳科(Tremellale)和子囊菌门的柔膜菌科(Helotiaceae)是影响各处理土壤真菌群落显著变化的Biomarker。

不同耕作方式土壤真菌群落的Alpha多样性指数如表2所示。其中observed_species代表观察到的物种数, Chao1和ACE代表菌群丰度, Shannon和Simpson代表菌群多样性, PD_whole_tree代表系统发育多样性, Good’s-coverage代表测序深度。由表2可知, 各处理文库覆盖率均在99%以上, 说明各样本测序深度合理。NTS处理土壤真菌丰富度和系统发育多样性大于TT1和SNTS, SNTS处理土壤真菌多样性大于TT1和NTS, 各处理间差异不显著。结果表明, 免耕和深松免耕能不同程度提高土壤真菌群落的丰富度和多样性, 但均未产生显著影响。

表2 不同耕作方式下土壤真菌群落的Alpha多样性指数Table 2 Alpha diversity indexes of soil fungal community under different tillage treatments

3 讨论

3.1 保护性耕作对土壤真菌群落组成的影响

土壤耕作会影响微生物群落, 促进或者抑制重要的生态过程, 影响土壤可持续性利用[20-21]。本研究结果表明, 与传统耕作相比, 长期保护性耕作小麦根围土壤真菌组成及相对丰度发生了显著变化,出现一些类群相对丰度增加或减少的现象, NTS处理出现了新的真菌类群。在本研究中, 3种耕作方式土壤真菌群落中子囊菌门、担子菌门、接合菌门均为优势菌门, 这与Wang等[15]的研究结果基本一致。其中相对丰度最高的真菌门为子囊菌门, 是农业土壤中最大的真菌类群, 受植物种类和秸秆残留降解影响较大, 其丰度随着养分添加而增加[22], 许多是重要的植物病原物[23]。而担子菌门的相对丰度随保护性耕作制度的实施而降低的原因, 可能是担子菌门可在厌氧环境下降解木质素及纤维素[24], 传统耕作土壤中的残留物可能有较高的木质素含量[5]。UPGMA结果表明, NTS和SNTS的群落结构较为相似, 与TT1的差异较大, 表明长期进行免耕覆盖和深松+免耕覆盖土壤真菌群落已基本趋为一致, 这与张贵云等[25]对该地区原核微生物群落多样性的研究结果相一致。本研究中TT1处理中具有显著差异的关键优势物种均属担子菌门, NTS和SNTS的均属子囊菌门, 也与上述结论相吻合。冯翠娥等[26]认为,接合菌门会引发植物病害, 破坏生物多样性。本研究结果发现采用保护性耕作土壤中的接合菌门增加,可能是秸秆还田中未经处理的小麦病残体增加了土壤病原菌的数量[27]。

保护性耕作的关键要素之一是管理农作物残留物, 使作物病害最小化[28]。土壤表面残留的作物残茬是后续作物某些病害的潜在接种源[29]。近年来, 秸秆还田和免耕等保护性耕作措施的推广应用, 为病原菌的生长、繁殖和积累提供了适宜的条件, 导致小麦土传病害的发生日益严重[30-31]。小麦赤霉病是小麦的主要病害之一, 其病原菌是一种子囊菌, 无性型是禾谷镰孢(Fusarium graminearum), 有性型是玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)[32]。本研究结果表明, 属水平上, 与传统耕作相比, 两种保护性耕作方式中赤霉菌属相对丰度增加, 且均为优势属。同时镰刀菌属相对丰度相较传统耕作也有所增加。说明该地区多年的保护性耕作会加大小麦赤霉病发生的风险。

3.2 保护性耕作对土壤真菌多样性的影响

保护性耕作能够为土壤微生物的生长繁殖创造有利的环境条件。在免耕和少耕系统中, 土壤表面的作物残茬比传统耕作更多, 从而增加了碳底物利用率, 提高了表层土壤微生物的生物量[33]。此外, 土壤真菌是以菌丝的形式生长, 对物理干扰非常敏感,保护性耕作由于减少了土壤扰动, 因而比传统耕作更有利于真菌形成能够捕获和运输营养物质的完整菌丝网络[31]。Li等[34]对1980—2018年间有关土壤微生物种群、群落结构及多样性变化对保护性耕作措施响应的多项研究进行了meta分析, 结果表明少耕加留茬覆盖增加了土壤微生物数量和真菌多样性,但总体而言, 耕作对微生物多样性和群落结构的影响依赖于所处环境。Degrune等[35]研究表明, 传统耕作下的土壤多样性高于少耕, 且作物残茬对微生物多样性没有影响。Li等[18]也通过meta分析认为真菌受干扰的影响较小, 免耕对细菌多样性有显著影响,但对真菌群落多样性无显著影响。本研究发现, NTS处理土壤真菌丰富度和系统发育多样性最高, SNTS处理土壤真菌多样性最高。可能是因为物种的多样性是由丰富度和均匀度综合评价的, 会因二者所占比重而不同[36]。虽然本研究中长期保护性耕作较传统耕作相比土壤真菌的丰富度和多样性增加, 但均未产生显著影响。一方面可能是因为黄土高原独特的气候和土壤条件, 而且本研究是建立在长期避免外源物质输入的基础上, 土壤内部环境可能已经稳定下来[37]; 另一方面可能是在整个耕作层的单一深度取样(0～20 cm)会掩盖土壤真菌群落多样性的差异[38]。

4 结论

本研究采用高通量测序技术, 对黄土高原旱地麦田多年不同耕作土壤真菌群落进行研究, 发现长期保护性耕作显著改变了土壤真菌群落结构及组成,提高了土壤真菌的丰富度和多样性, 但不存在显著差异。同时该地区多年的保护性耕作会加大小麦赤霉病发生的风险。因此, 在今后的土壤管理及保护性耕作推广中, 为缓解土壤压实及最小化病害, 应研究合适的秸秆还田频率、免耕与传统耕作或深耕轮作[39]以及适度的浅耕。