二甲双胍联合顺铂对黑色素瘤细胞的抑制作用及其机制研究

祁冰洁 任 煜 刘婷婷 刘慧娟 严其高 任丽英

安庆医药高等专科学校药学系 安徽安庆 246052；①教务处

化学药物辅助治疗在恶性黑色素瘤的治疗中具有重要的地位，对于存在高危因素的早期患者或处于病程中晚期的患者来说，应用于围术期可提高治疗效果[1]。顺铂是临床上多种化疗方案的主要药物之一，具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用[2]；二甲双胍可通过激活相应的信号通路抑制癌细胞的增殖[3]。本研究旨在探讨二甲双胍联合顺铂对恶性黑色素瘤细胞的抑制作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验细胞 小鼠恶性黑色素瘤细胞B16细胞株购于上海粒成生物科技有限公司。

1.1.2药物及试剂 顺铂(齐鲁制药有限公司，批准文号：20140372)，二甲双胍(美国Sigma公司，批准文号：20120056)，甲羟孕酮(美国Sigma公司，批准文号：23020715)。Bcl-2、Bax的反转录聚合酶联反应(RT-PCR)试剂盒、胎牛血清、胰蛋白酶购于上海生工有限公司，噻唑蓝(MTT)试剂盒购于美国eBscience公司，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购于美国Sigma公司，Bcl-2、Bax一抗购于碧云天生物科技研究所。

1.1.3仪器 PCR仪(Light Cycler 480，美国)，超净工作台(HEAR GU ARD ECO，苏州净化设备厂)，蛋白电泳仪、转膜仪(BIO-RAD公司)，紫外分光光度计(上海仪天科学仪器有限公司)。

1.2细胞处理及分组 应用胰蛋白酶将实验细胞消化为单细胞悬液，加入96孔板中，每孔180μL，细胞浓度为1×104个/孔。设空白组、对照组、给药组A、给药组B、给药组C、给药组D、给药组E。5% CO2、37℃下孵育12h，给药组A、B、C、D、E分别加入稀释后的二甲双胍和顺铂混合物(20μL)室温处理24h，具体给药浓度见表1。

表1 二甲双胍联合顺铂对恶性黑色素瘤细胞B16增殖的抑制作用

1.3MTT法检测二甲双胍联合顺铂对黑色素瘤细胞B16增殖的抑制作用 各组细胞加入MTT溶液20μL，37℃处理4h，再加入二甲基亚砜(DMSO )150μL，待结晶溶解后，使用紫外分光光度计检测490 nm波长处吸光度(A)值。计算细胞抑制率：细胞抑制率(%)=[1-(处理组A-空白组A)/(对照组A-空白组A)]×100%。实验重复3次。

1.4RT-PCR法检测二甲双胍联合顺铂对Bcl-2mRNA、BaxmRNA表达的影响 各组细胞提取总RNA，取1.5μg RNA进行反转录，并合成引物。采用RT-PCR法检测各组Bcl-2mRNA、BaxmRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.5免疫印迹法(Western Blot)检测二甲双胍联合顺铂对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 各组细胞使用含有PMSF的RIPA裂解液进行裂解，离心12000 r/min、15min后取上清液，Western Blot法检测各组Bcl-2、Bax蛋白表达量。应用Gel-ProAnalyzer成像系统进行灰度值分析。实验重复3次。

2 结果

2.1二甲双胍联合顺铂对恶性黑色素瘤细胞B16增殖的抑制作用 单因素方差分析结果显示，各给药组细胞抑制率抑均显著高于对照组(P<0.05)；且各不同浓度组间细胞抑制率差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2RT-PCR法检测各组恶性黑色素瘤细胞B16中Bcl-2mRNA、BaxmRNA的表达情况 单因素方差分析结果显示，各组间恶性黑色素瘤细胞B16中Bcl-2mRNA、BaxmRNA的相对表达量差异有统计学意义(P<0.05)。各给药组Bcl-2mRNA表达水平均显著低于对照组、BaxmRNA表达水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。给药浓度越高，Bcl-2mRNA表达水平越低，BaxmRNA表达水平越高。见表2。

表2 RT-PCR法检测各组恶性黑色素瘤细胞B16中Bcl-2mRNA、BaxmRNA的表达水平

2.3Western Blot法检测各组恶性黑色素瘤细胞B16中Bcl-2、Bax蛋白表达 单因素方差分析结果显示，各组间恶性黑色素瘤细胞B16中Bcl-2、Bax蛋白表达灰度值差异有统计学意义(P<0.05)。各给药组Bcl-2 蛋白表达灰度值均显著低于对照组、Bax蛋白表达灰度值均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。给药浓度越高，Bcl-2蛋白表达灰度值越低，Bax蛋白表达灰度值越高。见表3。

表3 Western Blot法检测各组恶性黑色素瘤细胞B16中Bcl-2、Bax蛋白的表达水平(灰度值)

3 讨论

恶性黑色素瘤是起源于神经嵴的黑色素细胞恶性转化形成的一种具有侵袭性、转移性的恶性肿瘤，发病后进展迅速、恶性程度高、预后差、复发率高[4-5]。据统计进展期的恶性黑色素瘤患者平均生存期为6～9个月[6]。美国疾控中心最新颁布的流行病学资料表明，近年来，黑色素瘤的发病率呈上升趋势，每10万人中有16人发病[7]。迄今为止，恶性黑色素瘤的病因和发病机制尚不完全清楚；日光照射、紫外线、遗传、种族、创伤、刺激、免疫功能失调等都是导致恶性黑色素瘤发生发展的重要因素[8-9]。临床上治疗恶性黑色素瘤的方法包括手术治疗、放射治疗、化疗、生物免疫治疗等[10]。手术切除是恶性黑色素瘤的首选治疗方法，但是对于可疑淋巴结区域的切除价值尚无定论。放射治疗能够对局部病灶进行控制，但也有学者建议，在手术切除淋巴结后，可考虑放射治疗。生物免疫治疗是基于患者免疫系统状态的一种治疗理念，是目前研究的热点，但经济成本较高，费用昂贵。全身辅助化治适用于病程中、晚期或病变早期的患者。顺铂具有调节机体免疫功能的作用，有研究发现在体外肺癌、结肠癌的模型中，顺铂预处理能够显著抑制肿瘤细胞的生物学行为[11]。陆海涛等[12]在研究中发现，顺铂抑制黑色素瘤细胞B16的增殖是通过增强细胞因子诱导的杀伤细胞的免疫调节功能实现的。二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线处方药物，近期的研究发现，在非糖尿病的恶性肿瘤(肺癌)患者中，二甲双胍具有潜在的化学预防作用[13]。李丽玲等[14]的研究发现，二甲双胍可通过激活AMPK信号通路抑制子宫内膜癌细胞的增殖。本研究观察了二甲双胍联合顺铂对小鼠恶性黑色素瘤细胞B16的作用及相关机制。首先，应用MTT法检测了二甲双胍联合顺铂对恶性黑色素瘤细胞B16增殖的抑制作用，研究数据表明，随二甲双胍、顺铂药物浓度的逐步增加，恶性黑色素瘤细胞B16增殖的抑制率明显升高。说明二甲双胍联合顺铂对恶性黑色素瘤细胞B16的增殖具有显著的抑制作用，且具有一定的剂量依赖性。

B淋巴细胞瘤-2基因简称Bcl-2，是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一，具有明显抑制细胞凋亡的作用[15]。Bax是与Bcl-2同源的水溶性相关蛋白，是Bcl-2基因家族中细胞凋亡促进基因，Bax的过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于死亡[16]。Bcl-2/Bax是细胞凋亡的重要调控因子，也是相关因子调控细胞凋亡的重要靶点和通路[17]。本研究应用RT-PCR法检测了二甲双胍联合顺铂对恶性黑色素瘤细胞B16中Bcl-2mRNA、BaxmRNA表达的影响；进一步应用了Western Blot法检测了各组恶性黑色素瘤细胞B16中Bcl-2、Bax蛋白的表达水平。研究数据表明，给药浓度越高，Bcl-2mRNA、Bcl-2蛋白的表达水平越低，BaxmRNA、Bax蛋白的表达水平越高。说明二甲双胍联合顺铂对恶性黑色素瘤细胞B16的凋亡过程发挥了一定的调节作用，促进其凋亡，抑制其增殖，且具有一定的剂量依赖性。

综上所述，二甲双胍联合顺铂对恶性黑色素瘤细胞具有协同抑制作用，可抑制其增殖，并加速凋亡进程，该作用机制可能与对Bcl-2/Bax凋亡蛋白的调控作用有关。