环丙沙星对血管平滑肌细胞表型转换的调控作用

黄尚军，黄筱然，陈国娜，杨航真，李 欣，4

［1.华南理工大学医学院，广州 510006；2.广东省人民医院（广东省医学科学院）全科医学科，广州 510100；3.华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006；4.广东省人民医院（广东省医学科学院）急诊科，广州 510100］

主动脉夹层（aortic dissection，AD）是各种原因引起的主动脉内膜中膜撕裂，可导致血液流入将主动脉分隔成真腔和假腔。AD 的病理学特征性改变是主动脉中膜血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）丢失和细胞外基质降解［1］。AD 的发生、发展与VSMCs 的状态和功能密切相关，AD 患者的主动脉中分泌型VSMCs 增多，收缩型VSMCs 减少［2-4］。大量临床研究发现包括环丙沙星（ciprofloxacin，CPFX）在内的氟喹诺酮类药物可增加AD 的发病风险［5-9］。CPFX 是一种人工合成的第三代氟喹诺酮类药物，通过抑制细菌DNA 拓扑异构酶IV 和DNA 回旋酶发挥抗菌作用，具有抗菌谱广、抗菌作用强的特点，临床应用广泛。一项关于CPFX 增加小鼠AD 易感性的研究发现，单用CPFX 仅能扩张主动脉内径，不能显著增加AD 发生率和破裂率，在高脂饮食和血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）构建的AD 小鼠模型中加入CPFX 后，AD 发生率和破裂率显著升高［10］。虽然目前有关于CPFX 增加AD 发病风险的研究，但其机制研究尚未完全阐明。因此，本研究旨在通过体外实验探讨CPFX 是否通过VSMCs 表型转换导致AD 发病风险增加。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本研究使用的VSMCs 来源于器官捐献患者的主动脉组织，标本收集遵循的程序符合广东省人民医院（广东省医学科学院）医学伦理委员会所制订的伦理学标准并得到该委员会批准（No.GDREC2018060H），且患者家属签署有知情同意书，对本研究知情同意。倒置显微镜（Nikon，日本）；荧光显微镜（Nikon，日本）；平滑肌肌动蛋白α（αsmooth muscle actin，α-SMA）（Ab5694）、平滑肌蛋白22（smooth muscle 22，SM22）（Ab10135）、类肌钙蛋白（calponin）（Ab46794）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyc⁃eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Ab9485）、Ki-67（Ab15580）均购自美国Abcam公司；骨桥蛋白（osteopontin，OPN）（BS1264）购自美国bio⁃world公司；电泳仪购自美国Bio-RAD公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）和Ang Ⅱ购自美国Sigma公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁公司；CPFX购自中国麦克林公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自中国爱尔兰Millipore 公司；Tris 缓冲液（tris buffered saline，TBS）购自中国博士德公司，吐温-20 购自中国索莱宝公司，电化学发光（electrochemilumines⁃cence，ECL）底物试剂盒购自中国Biosharp公司。

1.2 组织贴壁法分离培养血管平滑肌细胞方法

取手术切除的供体来源的新鲜主动脉血管，无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗血管表面的血液后于超净工作台内钝性分离主动脉内膜、中膜、外膜。将主动脉中膜组织剪成2 mm×2 mm 的碎块，并将碎块均匀地平铺于培养瓶内，倒置于二氧化碳培养箱中2 h，待组织块自然贴壁后翻转培养瓶，加入1 mL 完全培养基，定期更换培养基并观察组织块周围细胞情况，待组织块附近的细胞生长到70%～80%时，进行传代培养或实验干预。

1.3 免疫荧光染色方法

取生长状况良好的VSMCs 种于6 孔板内，待细胞生长融合到70%～ 80%时，弃除培养基，PBS缓冲液浸洗，4%多聚甲醛固定15 min，用含0.1%Triton X-100 的PBS 缓冲液通透20 min，含1% 胎牛白蛋白+10%胎牛血清的PBS 缓冲液封闭30 min后加入一抗，4℃孵育过夜。PBS 缓冲液浸洗后，避光条件下加入荧光二抗。室温避光孵育1 h 后滴加含DAPI 的封片剂复染细胞核，盖玻片封片，荧光显微镜观察，随机选择视野拍照并储存，图片后期叠加采用Image J 1.52a 版本（NIH，USA）软件。

1.4 CCK-8 检测方法

取生长状态良好的VSMCs 接种于96 孔板中，待细胞贴壁后，无血清培养基培养24 h。分别给予不同的药物干预，达到干预时间后，弃除培养基，按照说明书加入含CCK-8 试剂的培养基，二氧化碳培养箱内孵育1 h，全波长酶标仪检测吸光度，并分析检测结果。

1.5 Western blot 检测方法

取干预后的VSMCs，总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，按每孔30 μg蛋白计算上样量，100℃变性10 min。配置十二烷基苯硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳凝胶（SDS-PAGE），按照分组依次加样，恒压80 V 电泳30 min 后转为恒压110 V 电泳90 min。电泳结束后，将凝胶中的蛋白转印到PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，按目的蛋白分子量裁膜，与对应的一抗4℃摇床孵育过夜。TBST 洗膜，与二抗4℃孵育2 h，TBST 洗膜，ECL 发光液成像，ImageJ 1.52a（NIH，USA）测量灰度值，并统计分析。

1.6 统计学分析

本研究所有实验数据的统计分析采用GraphPad Prism 8.0.2（GraphPad Software，CA）软件。单因素多组间实验数据的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两因素多组间实验数据的比较采用两因素析因设计资料的方差分析（two-way ANOVA）。以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代培养的供体来源血管平滑肌细胞

主动脉中膜的主要细胞成分是VSMCs，通过组织贴壁培养法，VSMCs 能从主动脉中膜组织中迁移出来，并通过有丝分裂大量增殖。

图1 原代培养的VSMCs光学显微镜下图片（标尺=100 μm）

2.2 血管平滑肌细胞鉴定

免疫荧光染色检测VSMCs 标志物用来鉴定从主动脉中膜中迁移出来的细胞是否为VSMCs 并检测VSMCs 的纯度。VSMCs 的标志物有多种，本实验用来检测VSMCs 的标志物为SM22、α-SMA、cal⁃ponin。VSMCs 标志物阳性且有DAPI 标记细胞核的细胞为VSMCs，见图2。

图2 VSMCs表型鉴定荧光显微镜下图片（第一行绿色荧光为SM22阳性；第二行红色荧光为α-SMA阳性；第三行红色荧光为calponin 阳性；蓝色荧光为DAPI，用来染细胞核；标尺=100 μm）

2.3 环丙沙星干预后血管平滑肌细胞生长曲线

给予VSMCs 不同浓度的CPFX，干预不同的时间后，加入CCK-8，测量光密度（optical density，OD）值，对OD 值进行两因素析因设计资料的方差分析，选择CPFX 干预的最佳浓度和时间。通过统计分析，CPFX 在160 μg/mL 的浓度条件下，干预72 h 差异最显著（P<0.01），见图3。

图3 不同浓度CPFX 干预VSMCs 不同时间后CCK-8检测结果（n≥3）

2.4 不同药物干预血管平滑肌细胞后CCK-8检测结果比较

CCK-8 可检测CPFX、AngⅡ、CPFX+AngⅡ对VSMCs 增殖的影响，干预72 h 后，通过单因素方差分析发现，与对照组相比，CPFX 组OD 值减小，差异有统计学意义（P<0.01）；与对照组相比，CPFX+AngⅡ组OD 值明显降低，差异有统计学意义（P<0.001）；与CPFX 组相比，CPFX+AngⅡ组OD 值减小，差异有统计学意义（P<0.01），见图4。

图4 不同药物干预VSMCs72 h 后CCK-8 检测结果比较（n=8）

2.5 不同药物干预血管平滑肌细胞后Ki-67 染色结果比较

Ki-67免疫荧光染色发现，与对照组相比，CPFX组VSMCs 的Ki-67 相对阳性率降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与对照组相比，CPFX+AngⅡ组VSMCs 的Ki-67 相对阳性率明显降低，差异有统计学意义（P<0.001）；与CPFX组相比，CPFX+AngⅡ组VSMCs 的Ki-67 相对阳性率降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图5。

图5 不同药物干预VSMCs 后Ki-67 染色结果比较（A 图为荧光显微镜下图像，红色荧光为Ki-67 染色阳性，蓝色荧光为DAPI，标尺=100 μm；B 图为与对照组相比的Ki-67 相对阳性率，n≥33）

2.6 不同药物干预血管平滑肌细胞后各表型转换相关蛋白表达水平比较

Western blot结果显示，与对照组相比，CPFX组VSMCs 收缩型标志物calponin、α-SMA、SM22 表达水平降低（P<0.01），分泌型标志物OPN 表达水平升高（P<0.05），差异有统计学意义；与对照组相比，CPFX+AngⅡ组calponin、α-SMA、SM22 表达水平降低（P<0.01），OPN 表达水平升高（P<0.001），差异有统计学意义；与CPFX 组相比，CP⁃FX+AngⅡ组calponin、α-SMA、SM22 表达水平降低（P<0.05），OPN表达水平升高（P<0.01），差异有统计学意义，见图6。

图6 不同药物干预VSMCs 后各表型转换相关蛋白表达水平比较（A 图为VSMCs 表型转换相关蛋白的Western blot 检测结果，分别检测了VSMCs 收缩型标志物calponin、α-SMA、SM22 和分泌型标志物OPN；B 图为以GAPDH 为参照的VSMCs各表型转换相关蛋白表达水平比较柱状图，n≥3）

3 讨论

AD 是一种严重急性血管病，病死率高，其病因和发病机制错综复杂，常见的AD 病因和诱因包括原发性高血压（高血压）［11］、遗传［12］、炎症反应［13］、衰老［14］、VSMCs 改变［4］等。近年来，流行病学研究发现使用氟喹诺酮类药物后2个月内主动脉瘤和AD 的发生率增加［5，15-16］。2019 年5 月3 日，美国食品药品监督管理局警示CPFX 慎用于主动脉瘤患者和高风险人群。虽然流行病学研究发现氟喹诺酮类药物增加AD 发病风险，但流行病学研究有一定的局限性，如研究中没有明确氟喹诺酮类药物的使用是唯一的危险因素，没有明确氟喹诺酮类药物种类、使用时间和使用剂量等，且对于氟喹诺酮类药物增加AD 发病风险的机制不明。因此，单纯通过流行病学研究不足以证实氟喹诺酮类药物有增加AD 发病风险的作用。CPFX 是临床常用的氟喹诺酮类药物，本研究通过组织贴壁法分离培养供体组织来源的VSMCs，并通过免疫荧光染色鉴定分离得到的细胞为VSMCs。通过CCK-8检测选择CPFX 干预条件为160 μg/mL 干预72 h。AngⅡ是研究AD 的常用药物，AngⅡ干预浓度根据文献选择100 nmol/L［17-18］。CCK-8 检测和Ki-67 免疫荧光染色发现CPFX 可抑制VSMCs 增殖，且CPFX+AngⅡ对VSMCs 增殖的抑制作用强于单用CPFX。在CPFX 增加小鼠AD 易感性的研究中同样发现CPFX 可抑制VSMCs 增殖，且有剂量依赖性，本研究结果与文献结果吻合，不同的是本研究所使用的CPFX 浓度与文献不同，且本研究还发现CPFX+AngⅡ对VSMCs 增殖的抑制作用强于单用CPFX［10］。

VSMCs 是主动脉中膜的主要细胞成分，在病理性刺激下，VSMCs 出现去分化改变，收缩型的VSMCs 转变为分泌型的VSMCs［19］。大量研究证实VSMCs 表型转换在AD 的发生、发展中起着重要的作用［4，20-21］。本研究通过Western blot 分别检测VSMCs 收缩型标志物α-SMA、SM22、calponin 表达水平和分泌型标志物OPN表达水平［22］。发现CPFX可引起VSMCs 收缩型标志物表达水平降低，分泌型标志物表达水平升高。本研究发现CPFX 可引起VSMCs 由收缩型向分泌型转换，且CPFX+AngⅡ引起VSMCs 表型转换的作用强于单用CPFX。本研究结果提示VSMCs 表型转换可能是CPFX 增加AD 发病风险的一种原因。

本研究虽明确了CPFX 可引起VSMCs 表型转换，且可能是CPFX增加AD发病风险的原因，但是，在AD的众多病因和诱因中，高血压是最主要的致病因素，在AD患者中，超过50%以上有高血压［23］。AD虽然是CPFX的严重药物不良反应，但发生率较低，并不是AD的主要致病因素，且在临床使用过程中，CPFX 的血药浓度远低于本研究中使用的浓度［24］。因此，虽然CPFX 可增加AD 发病风险，但并不影响CPFX的临床使用，只需注意CPFX慎用于动脉瘤和高风险人群。本研究也有一定的局限性，对于CPFX引起VSMCs表型转换的机制仍需进一步研究。