甘蔗根腐病及其致病镰刀菌研究进展

任庆肖，张金旭，张木清

(1广西大学农学院，广西南宁530000；2广西甘蔗生物学重点实验室，广西南宁530005；3亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530005)

0 引言

甘蔗是我国最重要的糖料作物，其产糖量占全国食糖总产量的90%以上[1]。同时，甘蔗是世界上第2大生物能源作物，提供了全球约80%的糖和40%的乙醇产量，广泛种植于热带和亚热带地区[2]。当前我国甘蔗主产区为广西、云南和广东3省，其中广西地处热带和亚热带气候，占全国甘蔗生产总量的60%[3]。甘蔗是禾本科宿根作物，经过连年种植，病原菌在植株体内或土壤中逐年积累，造成病害严重，种性退化，对甘蔗高产高糖构成严重威胁[4]。病害是抑制甘蔗生长和制约蔗糖产业发展的重要因素，据统计，已知的甘蔗病害在全球范围内共有160多种，在我国有50多种属于侵染性病害[5]。甘蔗根腐病是一种发生在甘蔗根部的土传性病害，在全球范围内均有发生，是制约甘蔗产业持续健康发展的因素之一。镰刀菌种类繁多，植物病原镰刀病菌多具土传性，能够引起多种作物的枯萎病、梢腐病和根腐病等，是最具经济破坏性的真菌致病菌群之一[6]。甘蔗根腐病2018年在中国广东首次被报道，在拔地拉根系中发现并分离出引起甘蔗根腐病的镰刀菌(Fusarium commune)，其感病植株的根系呈褐色或腐烂、长势弱、活力差，造成大面积减产[7]。Fusarium commune是尖孢镰刀菌的近缘种，近年来此菌逐渐被发现，其能够引起豌豆、白松、康乃馨、玉米、胡萝卜[8]、道格拉斯冷杉[9]、美国森林苗圃[10]、水稻[11]、大豆[12-13]、烟草[14]、豇豆[15]、番茄[16]、软枣猕猴桃[17]、鹅不食草[18]、龙胆[19]、辣根[20]等多种作物的根腐病，此外还可导致烟草茎腐病[21]、冬瓜叶斑病[22]、玉米穗腐病和茎基腐病[23-24]、荷花腐败病[25]、荸荠枯萎病[26]、百合枯萎病[27]、花旗松幼苗立枯病[28]等，可见Fusarium commune是一种地理分布和寄主范围广泛的致病菌。所以加强甘蔗根腐病的检验检疫、病害检测和综合防控非常重要。本研究概述了甘蔗根腐病及其病原菌种类、分离与鉴定、生物学特征和致病机理等方面的研究进展，并提出针对性的防控策略，展望以后研究的方向和急需解决的问题，希望为我国的甘蔗根腐病防控和未来抗病分子育种提供参考。

1 甘蔗根腐病病害基本情况

1.1 甘蔗根腐病的分布与危害

从19世纪末开始一直持续到21世纪，甘蔗根腐病一直受到甘蔗界的广泛关注。20世纪20年代，美国路州由多种腐霉引起的甘蔗根腐病爆发[29]，后在爪哇、西印度群岛、夏威夷、路易斯安、澳大利亚等地根腐病也陆续被报道[30-31]。1980年中国台湾地区首次报道甘蔗根腐和茎基腐病[32]。2015年墨西哥首次报道甘蔗茎腐病，其患病的甘蔗表现出茎和根腐烂的症状[33]。2016年DESHMUKH N J提出甘蔗枯萎病和根腐病是马哈拉施特拉邦(印度)甘蔗种植的主要威胁[34]。2018年中国广州甘蔗种植区首次发现根腐病[7]。2020年印度尼西亚蔗区报道与台湾地区相似的甘蔗根腐和茎基腐病，其造成严重的减产[35]。甘蔗根腐病发生后轻则引起植株枯萎黄化，植株萎缩生长缓慢，分蘖数减少。重则致使植株死亡，造成大面积减产，在宿根地中，土壤中残留病原菌也会影响甘蔗出芽。

1.2 甘蔗根腐病病害的典型特征

甘蔗根腐病主要表现为中胚轴和整个根系逐渐变褐、变软、腐烂，根系生长严重受阻；植株矮小，叶片发黄，幼苗死亡。甘蔗发病初期叶片呈黄色，生长缓慢，根部呈黄褐色，附着土壤的能力开始减弱，植株地上部分难以观察到明显变化；发病中期，根部呈现红褐色，附着土壤的能力进一步减弱，次生根数目减少；发病后期叶片干枯，根部呈黑褐色并且大多数已经腐烂，附着土壤的能力丧失，严重时植株枯黄而死(图1)。

图1 甘蔗根腐病田间表现

1.3 甘蔗根腐病的传播途径与流行规律

近年来，甘蔗根腐病在果蔗种植地区持续加重，主要有以下几个因素：一是气候影响，甘蔗在国内主要种植在广东、广西、云南、福建等地，栽种之后雨水天气较多，造成田间持水量高，空气湿度大，透气性差，这种条件正适合主要病原菌的滋生侵染；二是目前国内主栽品种对于根腐病抗性较差，容易感染此病害，而且多数蔗农采取宿根种植，病原菌残留在土壤内，所以病害连年加重；三是广东高发地区土壤多为黏土，深耕机械作业困难，呈酸性(pH 3～5)，有利于病原菌生存与繁殖；据调查，该病发生与耕作习惯也有一定关系，根腐病重灾区农户施用大水大肥，肥料撒施于土壤表面，大水漫灌后肥料溶于表层土壤，所以根系多存在于土壤浅层部分吸收养分，不利于根系下扎。而且发病初期用药量多，也使得病原菌抗药性加强，后续防治难度加大。此外，该病在发病前中期不易发现，一般甘蔗栽培后5～7个月左右才会出现明显症状。该病病原菌主要通过水、泥土进行传播，轮作水稻、西芹等作物会加快病菌传播。

2 甘蔗根腐病致病菌概述

2.1 甘蔗根腐病致病菌

能够导致甘蔗根腐病发生的主要病菌有Pythium arrhenomane、Pachymetra chaunorhiza[29-31]、Xylariasp.[32]、Macrophomina phaseolina、Fusarium moniliforme.andPythium gramenicolasp.[33]、Fusarium commune[7]、Xylaria arbuscula[34]。Pythium arrhenomanes在CMA培养基上菌丝呈白色，无隔膜。附着在卵孢子上的雄器数在1～6个之间，可观察到游动的孢子囊。Pachymetra chaunorhiza的卵孢子由细长的营养菌丝单独发育而成，或由小菌丝结簇而成，较大，具有多个疣状突起。雄器多生于卵孢子梗，膨胀并与疣之间的卵孢子顶端接触。Macrophomina phaseolina在PDA上菌落密集生长，开始呈灰色，然后逐渐变黑，菌核在5～10天后产生，分生孢子座通常为黑色，单生球状，具截形孔洞。产孢细胞透明，倒梨状或近圆柱状。分生孢子透明，圆柱形或椭圆形，单细胞。Fusarium commune可在PDA平板上25℃恒温箱环境下进行培养，气生菌丝呈绒毛状，可产生大小分生孢子，小孢子呈椭圆形，大孢子呈月牙形。Xylaria arbuscula在OA培养基上菌落呈棉白色，从中心开始变暗，培养4天后，在黑暗区域和培养皿边缘观察到白尖叠层结构。有性子座笔直，单生或丛生。子囊孢子为椭圆形，末端为窄圆形，侧腹部存在直的芽缝。

2.2 致病镰刀菌生物学特性

《真菌鉴定手册》[36]所描述的镰刀菌株属下真菌的主要特征：分生孢子梗单生或集成分生孢子座，细长或粗短，单枝或分枝，或产生轮辐状排列的瓶形小梗。分生孢子无色，变异很大，常埋藏于胶质物内，有大小型2种：大型孢子多细胞，微弯或两端尖而弯曲显著，镰刀形；小型孢子多数单细胞，卵形或长圆形，单生或成串，间有2～3细胞构成的，长圆形，直或微弯。在培养中产生大量气菌丝呈棉絮状，菌丝在培养基中常产生色素而呈红、紫、黄等色。

引起不同作物根腐病Fusarium commune也存在一定差异。在PDA平板上菌落呈白色、粉色、浅紫色等颜色，生长过程中会出现颜色的变化，气生菌丝多呈绒毛状。小孢子较多，卵形或椭圆形，大孢子月牙形，微微弯曲，两端均匀变尖，一般为3～5个隔膜。在SNA培养基上分生孢子梗有粗短型单瓶梗、大于25 μm的细长型单瓶梗以及黑暗培养时产生的复瓶梗3种[14,17,25,27]。

从甘蔗根腐病分离出的Fusarium commune菌株在PDA培养基上菌丝紧贴培养基生长，气生菌丝为绒毛状，颜色为白色，平均日生长量为7 mm，培养基不变色，在光学显微镜下可观察到大小孢子，小孢子多呈椭圆形，大孢子较少呈月牙形两端变尖，隔膜一般为1～2个。分生孢子梗可观察到短粗或细长的单瓶梗以及复瓶梗。

2.3 甘蔗根腐病病原菌分类与鉴定

从1809年Link发现镰刀菌并命名为粉红镰刀菌至今，镰刀菌的分类一直是相对困难的问题，镰刀菌在不同培养基和不同生长时期，其菌落颜色和纹理、分生孢子梗形态以及孢子大小等会发生变化甚至会出现亚种间的变化[37]。因此仅通过形态学特征并不能准确地揭示镰刀菌物种的多样性[38]。随着分子生物学技术的发展，基于多基因的系统发育分析可以快速准确地鉴定镰刀菌种属之间的关系[39-40]。2003年Skovgaard等人从豌豆根腐病土壤中分离鉴定出Fusarium commune，并确定其为新菌种(即尖孢镰刀菌复合种的姐妹种)[41]。2013年O'Donnell等人利用基于DNA定向的部分RNA聚合酶II大亚基(RPB1)和第2大亚基(RPB2)的系统发育分析方法[42]，揭示了镰刀菌属的起源并提供了一种较为全面的种的分类，将Fusarium commune划入Fusarium nisikadoispecies complex中[43]。

国内报道甘蔗根腐病主要致病菌为Fusarium commune。Fusarium commune属于真核生物界(Eukaryota)、子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、丝核菌科(Hypocreomycetidae)、烟花镰刀菌复合种(Fusarium nisikadoispecies complex)。Fusarium commune可采用真菌ITS序列通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCT CCGCTTATTGATATGC)[43]，EF1(ATGGGTAAGGA RGACAAGAC)和EF2(GGAAGTACCAGTSATCAT GTT)进行PCR扩增[44]。随着研究的进一步深入，学者研究出多对Fusarium commune专用引物，例如Stewart[45]等人设计的efFc100F(GGGGTATTTCTCA AAGGCAATATGC)和efFc385R(ATGCGCTCATTGA GGTTGTGG)，朱志贤[46]设计的FO1(GCCATAGGT CAGATAACCAGTT)和FO2(TCACTACTGGTGTCA GAAAGGG)等用于菌株的分子生物学鉴定。

3 甘蔗根腐病致病镰刀菌接种方法和分级标准

3.1 接种方法

接种方法会对植株发病情况产生很大影响，在病原菌进行致病性鉴定和不同致病性病原菌筛选中可能会产生一定的偏差。高效接种方法可以快捷、准确地找到强致病菌，大大缩短在病原菌筛选中所耗费的时间，提高实验效率。

甘蔗根腐病病原菌致病力鉴定可采用室内接种法和田间接种法。由于田间各种因素变化较大，加之甘蔗根腐病方面研究薄弱，贸然采用田间接种容易引起较大风险，所以更多采用室内鉴定法。室内鉴定通常采用直接浇灌法、灭菌土盆栽接种法、孢子悬浮液浸泡接种法和针刺法。

直接浇灌法：将纯化后的菌株在PDA平板培养5～7天或者在PDW液体培养基培养2～3天后，从培养基上用挑针轻轻刮下孢子，制备浓度为1.0×106CFU/mL的孢子悬浮液。将蔗茎用合适浓度的灭菌灵消毒后在25℃条件(期间保持湿润)下催芽7天。每株甘蔗接种10 mL孢子悬浮液，对照接种等量无菌水，接种时沿着根系周围缓缓倒入，保证孢子悬浮液均匀渗入根系周围。14天后观察发病情况。

灭菌土盆栽接种法：将纯化后菌株在平板上培养5～7天，将菌落打成直径0.3 cm的菌块用于接种。将适量灭菌土和灭菌蛭石与适量菌块混合均匀，将催芽7天后甘蔗种茎栽入其中，对照不混合病菌。接种后在温室进行培养，14天后观察甘蔗根系受到侵染情况。

孢子悬浮液浸泡接种法：将纯化后的菌株在PDA平板培养5～7天(或者PDW液体培养基培养2～3天后)，从培养基上用挑针轻轻刮下孢子，将孢子悬浮液浓度调至1.0×106CFU/mL。制备充足孢子悬浮液，将催芽7天的甘蔗种茎浸入孢子悬浮液中10～15 s，确保根系充分均匀接触到孢子悬浮液，然后将种茎移植到灭菌的培养基质和蛭石混合土壤中，置于温室中培养14天后，观察发病情况。

针刺法：病原菌纯化后在培养基培养5～7天，制备浓度为1.0×106CFU/mL的孢子悬浮液，用无菌注射器将10 mL孢子悬浮液注射至甘蔗种茎中，然后将注射过孢子悬浮液种茎栽培至灭菌蛭石中，2～3周后观察甘蔗植株的发病情况。

张尚卿[47]等运用茎基接种和浸根接种法对番茄植株进行接种，结果表明，茎基接种根腐病发病率和死亡率均高于浸根接种。夏蕾[48]等采用灌根和全株喷雾2种方法用灰霉病病原菌进行接种，结果表明灌根法发病率和植株症状明显高于全株喷雾法。吴学宏[49]等用西瓜枯萎病菌孢子悬浮液采用灌根法、浸根法和蘸胚根法进行西瓜幼苗接种试验，浸根法接种发病率高达94.7%。根据笔者的前期试验，孢子悬浮液浸泡法在接种后效果最好、植株发病率更高，直接浇灌法次之。所以在根腐病接种实验中更推荐采用浸根法，浸根法可以将孢子均匀的接种在根系，更便于病原菌在不同部位侵染。

3.2 分级评价标准

对于甘蔗根腐病而言，目前还没有统一的评价标准。现参考大豆[50-52]等作物根腐病的分级标准，为甘蔗根腐病分级标准做出简单概述。甘蔗根腐病可采取0～4级标准评价(见表1)：0级，根部健康，根系无侵染症状；1级，根系出现轻微损伤(0～20%)，颜色开始变为淡褐色，但无腐烂症状；2级，受损伤部位开始蔓延(20%～40%)，淡褐色根系部位增多，出现腐烂症状；3级，根系受侵染严重(40%～70%)、附着土能力急剧下降，新生根明显减少，受侵染根系淡褐色逐渐转为黑褐色；4级，整个根系发病严重(70%以上)，整根腐烂，地上部分枯萎。

表1 甘蔗根腐病分级标准

4 甘蔗根腐病镰刀菌侵染与致病机理

致病菌侵染植株以后，会通过不同的部位和方式入侵细胞。部分菌株会首先定植到细胞表面，然后通过细胞间隙或者细胞表面等方式侵入细胞。Christina Hall等[53]对侵染后的菌丝用甲苯胺蓝进行染色，观察植株感染情况，发现分生孢子萌发后在根周围形成广泛的菌丝网。菌丝对表皮细胞的穿透最常见于根毛区，在菌丝通过细胞内和细胞间生长侵入皮层之前，首先在根毛和表皮细胞定殖。康振生[54]研究了禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)在小麦穗部的侵染过程，菌丝萌发后首先从细胞间进行生长，随后突破细胞膜进入细胞，并没有发现菌丝从气孔侵入。同时，也有学者通过电镜对立枯丝核菌侵染马铃薯进行研究[55]。

随着研究的发展，GFP基因被广泛运用到镰刀菌、霉菌、炭疽病毒等侵染植物流程的研究当中。黄国存等人利用构建好的禾谷镰刀菌菌株侵染玉米叶片后观察到侵袭性菌丝在接种后24 h内生长，36～48 h内在细胞间生长，72 h后完全占据侵入细胞[56]。以草莓根腐病HYG为选择标记基因进行侵染过程研究，发现孢子附着在根表面，通过芽管侵染根部，菌丝顶端产生吸盘状结构侵染草莓植株。一旦进入，菌丝生长主要集中在表皮和皮层组织，在定殖后的维管组织中只检测到少量菌丝[57]。GFP转化子侵染玉米后发现两个转化子都侵染玉米，菌丝从根到茎侵染植株，并延伸到穗部，感染的穗粒引起二次侵染[58]。FO-GFP菌株对西瓜根系进行侵染后发现，1天菌丝开始萌发，2～3天菌丝逐渐进入根系细胞，同时发现侵染过程中茉莉酸(JA)途径受到影响[59]。刘勇勤[60]利用GFP标记的FOC-4回接感病香蕉(巴西蕉)发现菌丝以2种形式进行扩散，一种是从细胞间隙无规则扩散，另一种是以细胞间扩散和细胞内生长方式交织在一起扩散。草莓炭疽菌发现孢子从细胞间隙向胞内扩散逐渐形成明显病斑[61]。也有学者在大豆疫霉病[62]、马铃薯炭疽病[63]运用GFP转化子进行侵染过程研究，说明GFP转化株可以稳定地应用到实验当中。

镰刀菌在侵染植株后，会产生多种次生代谢毒素。例如赤霉素会造成寄主生长延缓同时促进自身的生长发育，促进病菌的侵染[64]。镰刀菌酸可以增加细胞膜的通透性，加速病原菌的侵染进程[65]。此外，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)也是一种多次被报道的镰刀菌毒素，此毒素不仅作用于植物，对人和动物的健康也有一定威胁[66-68]。

植物受到镰刀菌侵染时，病原菌会分泌多种促进植物细胞降解的酶，来帮助病原菌穿透植物的防御系统。对于植物而言，植物防御酶是植物抗病能力的一个重要指标，包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等。PAL酶的变化认为是抗病性表现的重要指标[69-70]。利用病原信号诱发健康植株，发现植株细胞壁木质化的同时导致苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶等防御酶系的增加，表明防御酶系会参与寄主细胞壁的木质化过程[71]，在菌株侵入后就会影响这些酶的分泌。Fusarium commune能够分泌多种纤维素和半纤维素降解酶来分解植物的细胞壁，加速细胞的降解[72]。笔者通过研究发现，引起甘蔗根腐病的Fusarium commune会通过不同的方式侵染细胞，首先孢子会定殖在细胞表面，通过细胞间隙或者从表面穿破细胞，侵入细胞后沿着细胞间隙进行传播，逐步对根系进行侵染，造成根系腐烂。

5 甘蔗根腐病主要防控措施

5.1 选育和采用抗病品种

由于甘蔗根腐病是由多种病菌混合侵染引起的一种土传病害，所以选育和利用抗病、耐病品种是防治该病的主要方向。不同品种对于根腐病抗性不同，但很多主流品种不耐储藏和运输，生产上仍然缺乏相应高抗品种，因此不断开发高抗品种是保证甘蔗高产稳产的方法之一。

5.2 切断病害传播途径

甘蔗作为一种种茎栽培的作物，首先在栽培时应当注意砍种机和刀具的消毒清理，减少病原菌的互相传播；在机械收获时应当注意收获刀具消毒和处理。同时加强外地种茎的检验检疫工作，防止病原菌进一步扩散。

5.3 化学防治

筛选合适的化学药剂，可以为防治Fusarium commune引起的甘蔗根腐病提供依据。李润根[27]等人的室内毒力测定试验表明，75%肟菌·戊唑醇对Fusarium commune的毒性最强，抑菌效果最好，这与张河庆[15]等人的结果相同。朱志贤[46]在荸荠枯萎病的防治研究中发现，10%苯醚·戊唑醇对室内Fusarium commune菌丝生长的抑制效果最好，其次是25%多菌灵、40%氟硅唑等。李庆[73]研究发现戊唑醇对Fusarium commune活性的抑制效果最好，并将其应用在玉米种子包衣处理中，有效提高了玉米出苗率，这对甘蔗进行种茎药剂处理以防治根腐病提供了一定的参考价值。

播种前采用咯菌腈、烯唑醇、戊唑醇等质量效果较好的杀菌剂包衣拌种。目前生产上防治甘蔗根腐病药剂报道较少，主要为50%异菌脲、25%咪鲜胺，在甘蔗小培土时4 kg 50%异菌脲溶于200 kg水中(公顷药量)，稀释后将喷雾器喷头喷片去掉，将药液喷淋在甘蔗根茎部；培大土之后再次施药，药效持续时间约为4个月，能够减少部分损失。也有农户在播种前施用112.5 kg/hm2高锰酸钾，整块地泡水10天对地块进行消毒，对防治根腐病有一定效果。

5.4 加强田间管理，改进栽培方式

播种前对田块进行消毒，采用效果较好的杀菌剂包衣拌种，田间增施有机肥、磷肥和钾肥，提高甘蔗的抗病和耐病能力；及时清除田间病株残体，防治根部害虫，以便减少土壤菌源和其它病原菌的侵入途径。

6 展望

根腐病是甘蔗主要真菌性病害之一，目前我国果蔗的主产区广东省蔗区发病严重，对果蔗行业的健康发展构成很大威胁。目前我国蔗区Fusarium commune的遗传变异逐步地被发现，可能存在多种株系，已经造成了多种作物的不同病害。根据甘蔗根腐病的传播和发病流行规律，我国蔗区存在该病害爆发流行的风险，未来有可能成为甘蔗的流行病害，应该引起一定重视，同时进一步加强对发生流行规律、监测防控机制和致病机理等方面的研究。

甘蔗的遗传背景复杂以及不同地区的甘蔗栽培手段不同，受环境影响较大，极大地阻碍了甘蔗常规育种进程。而且目前对于Fusarium commune引起的甘蔗根腐病研究还停留在较为初步阶段。对甘蔗根腐病的致病菌种类、互作侵染关系研究有待完善，接种方法、分级标准也有待进一步发掘。根腐病的发生日益严重，而很多先进的育种方法暂未应用到甘蔗根腐病的育种进程中来，所以应进一步开展对该病害的研究。随着生物信息学技术和高通量测序技术不断发展，利用转录组测序、蛋白组测序、单细胞转录组测序等技术，开展更精细的病原菌与植物互作机制的研究，将对未来病害防治、分子育种产生更加深远的意义。