枯草芽孢杆菌YZU-S149的分离鉴定及对西瓜枯萎病的生防作用

孙正祥，龙欣钰，孟祥佳，曹帅，毛国庆，周燚

1.长江大学农学院，湖北 荆州 434025 2.湖北省农林病虫害预警与调控工程技术研究中心(长江大学)，湖北 荆州 434025

由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusariumoxysporumf. sp.niveum, FON)(病原真菌西瓜枯萎病菌)引起的西瓜枯萎病是一种土传病害，是西瓜生产中发生最广泛、危害最严重的病害之一，发病率较高，甚至可导致绝收[1]。西瓜枯萎病菌的厚垣孢子可以在土壤中生存长达10年，并且能够在多种作物上生存，这给疾病控制带来了困难[2,3]。目前尚无理想的防治方法，嫁接防治会影响西瓜的口感及品质，抗病品种培育周期长，且易丧失抗病性；化学农药高剧毒高残留，对人畜有毒害作用[4,5]。而生物防治相对安全有效，符合可持续性农业发展要求，因此利用微生物制剂防治西瓜枯萎病具有重要的实践意义。近年来，利用生防菌株防治西瓜枯萎病已有不少相关报道，如非致病镰刀菌(Fusariumspp.)[6]、芽孢杆菌(Bacillusspp.)[7]、绿色木霉(Trichodermviride)[8]和绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)[9]等。然而上述生防菌株大多数存在田间效果不稳定、货架期短等问题[10]。对节白蜡(Fraxinushupehensis)首先发现于湖北，为中国特有种，具有重要的药用价值，鲜有病虫害发生[11]，推测其体内含有能产生抗菌活性物质的微生物，帮助其免于病虫害为害。目前，国内外对对节白蜡的研究主要集中在园林园艺[12]、人工栽培[13]、化学成分[14]等方面，但对于对节白蜡内生菌的研究鲜有报道。为此，该研究从对节白蜡根部和根际土壤中分离筛选对西瓜枯萎病菌具有较强拮抗作用的细菌，测定其抑菌谱、生防特性及盆栽防效，以期为西瓜枯萎病生防制剂的开发与应用提供有效的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病原真菌西瓜枯萎病菌、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)和玉米茎基腐病菌(F.moniliforme)均由本课题组分离与保存。

西瓜品种为西农八号，由西北农林科技大学选育。培育西瓜所用的基质土为长江大学农学院自行研发的育苗专用土。

培养基包括营养肉汤培养基(NB)及其固体培养基(NA)、马铃薯葡萄糖培养基(PDB)及其固体培养基(PDA)、几丁质酶检测培养基[15]、蛋白酶检测培养基[16]、纤维素酶检测培养基[17]、嗜铁素检测培养基[18]。

1.2 西瓜枯萎病生防菌株的筛选及其生防特性的测定

1.2.1 生防菌株的分离与纯化

称取1g对节白蜡幼根组织，采用75%的酒精浸泡1min，4%的NaClO浸泡 5min，将消毒后的根部组织用无菌水冲洗3次后于无菌研钵中充分研磨，取所得研磨液依次稀释至10-4、10-5和10-6，每个浓度取100μL涂布于NA平板。另取对节白蜡根际土约10g，倒入100mL三角瓶中并加入90mL无菌水，于130r/min、28℃条件下培养30min制成母液。将母液依次稀释至10-6、10-7和10-8，分别取100μL稀释液涂布于NA平板。将上述平板置于培养箱中，28℃恒温培养，每个浓度重复3次。2～3d后挑取形态、颜色和大小等不同的单菌落，转接至斜面培养基中，4℃保存备用。

1.2.2 拮抗菌株的筛选及抑菌谱的测定

1)初筛。将PDA平板上培养5d的西瓜枯萎病菌菌饼(6mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼中心2.5cm对称划线接种待测菌株，28℃恒温培养，4d后测量抑菌带的大小。

2)复筛。采用平板对峙法，挑取培养了5d的西瓜枯萎病菌菌饼接种至PDA平板中央，在与平板中央等距离的3点处用无菌打孔器对称打孔，向孔中注入振荡培养2d的待测菌液，每孔50μL，28℃恒温培养，待对照西瓜枯萎病菌长至2/3时，测量菌落半径并计算抑制率[19]。抑菌谱测定：选择抑菌活性较强的菌株，采用与初筛相同的方法测定其对马铃薯晚疫病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌和玉米茎基腐病菌的抑菌活性。

1.2.3 拮抗菌株的生防特性

1)几丁质酶活性检测。取培养2d后的拮抗菌发酵液10μL，接种至几丁质酶检测平板上，28℃培养3d后观察拮抗菌菌落周围有无透明圈。

2)蛋白酶活性检测。用牙签挑取培养好的拮抗菌接种至蛋白酶检测平板中央，28℃培养3d后，观察菌落周围有无透明圈。

3)纤维素酶活性检测。将拮抗菌株接种到纤维素酶活性检测平板上，28℃恒温培养3d，向培养皿中加入1mg/mL的刚果红溶液至平板表面完全被浸没，静置30min，弃染液，用1mol/L的NaCl溶液洗涤，观察菌落周围有无透明圈。

4)嗜铁素检测。将待测菌株接种到嗜铁素检测培养基上，28℃培养3d，观察是否出现黄色晕圈。

1.3 盆栽防效测定

选择健康饱满的西瓜种子催芽后挑选出芽一致的西瓜种子分别播种至装有无菌基质土的育苗盆中，于温室中((28±2)℃，光照时间∶黑暗时间=16h∶8h)培养。待西瓜苗长出3片真叶时，将其移栽至装有病土的盆钵中。试验设置5个处理：①YZU-S7+FON；②YZU-S146+FON；③YZU-S149+FON；④百菌清500倍稀释液+FON；⑤NB+FON。

西瓜枯萎病菌分生孢子悬浮液的制备：挑取西瓜枯萎病菌的菌饼接种至PDB培养基中，28℃、130r/min培养5d，采用血球计数板测定其孢子浓度。接种时将分生孢子悬浮液与无菌基质土混合均匀制成病土(1×105cfu/g)。

细菌悬浮液的制备：活化菌株YZU-S7、YZU-S149和YZU-S146后，将其分别接种至NB培养基中，28℃、130r/min培养48h，制成浓度为1×108cfu/mL的菌悬液。

移栽西瓜苗后采用灌根法接种细菌悬浮液，每株5mL。每隔5d进行1次试验处理，共处理3次。以接种等体积NB培养基为对照，每处理10株西瓜苗，3次重复。在最后一次接菌后第18天调查各处理西瓜苗的发病情况，计算其病情指数和防效[20]。

1.4 拮抗菌株的形态学及分子鉴定

将筛选出来的具有拮抗作用的菌株接种到NA培养基上，观察并记录其菌落的形态、边缘、颜色、大小及光泽等。使用OMEGA细菌基因组提取试剂盒提取YZU-S149 DNA，并采用16S rDNA通用引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R: (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′) 进行PCR扩增。反应体系(40μL)：PCR StarMix 20μL、正引物1.0μL、反引物1.0μL、DNA模板 2.0μL和ddH2O 16μL。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性40s、58℃退火40s、72℃延伸60s，共30个循环；72℃再延伸10min。取少量PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至擎科新业生物技术有限公司测序。将测序结果在GenBank数据库中比对分析，采用MEGA 7软件构建系统发育树。

1.5 数据处理

试验所得数据采用SPSS 20.0软件进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的分离和初筛

从对节白蜡幼根及根际中共分离出细菌303株，对西瓜枯萎病菌表现出拮抗作用的菌株共有50株，其中拮抗带宽大于5mm的有14株，大多为内生菌(见表1)。

表1 西瓜枯萎病拮抗细菌的分离与初筛

2.2 拮抗菌株的复筛

西瓜枯萎病拮抗细菌的复筛结果表明，菌株YZU-S7、YZU-S149和YZU-S146对西瓜枯萎病菌的拮抗效果较好，抑菌率分别为68.90%、73.51%和75.34%(见表2和图1)。

表2 西瓜枯萎病拮抗菌株的复筛

图1 拮抗细菌对西瓜枯萎病菌的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of antagonistic bacteria on watermelon Fusarium wilt

2.3 拮抗菌株的抑菌谱及生防特性测定

抑菌谱测定结果表明，菌株YZU-S7、YZU-S149和YZU-S146对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、玉米茎基腐病菌和马铃薯晚疫病菌均有较强的拮抗作用(见表3和图2)。生防特性的测定结果显示，这3株菌株均能产生蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素，但不产生几丁质酶。

表3 拮抗菌株的抑菌谱测定

2.4 拮抗菌株对西瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽试验结果表明，在最后一次接菌后18d后，菌株YZU-S7、YZU-S149和YZU-S146对西瓜枯萎病的防效分别为51.76%、75.87%和65.48%，其中菌株YZU-S149的防效最好，且菌株YZU-S149和YZU-S146的防效均高于对照药剂百菌清(见表4)。

表4 3株拮抗菌株对西瓜枯萎病的盆栽防效(接菌后18d)

2.5 生防菌株的鉴定

菌株YZU-S149的菌落扁平，正面呈灰白色，反面呈黄色，表面无光泽，略微干燥，边缘不规则，菌落正中间较平坦，四周有明显的皱褶隆起。16S rDNA序列分析表明，菌株YZU-S149的序列与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)IAM12118的序列相似度为100%。系统发育树显示，菌株YZU-S149与枯草芽孢杆菌处在同一分支上(见图3)，初步鉴定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。

注：A为水稻纹枯病菌；B为小麦赤霉病菌；C为玉米茎基腐病菌; D为马铃薯晚疫病菌。图2 菌株对4种病原菌菌丝生长的抑制作用Fig. 2 The inhibition effect of strains on mycelial growth of four pathogenic fungi

图3 基于YZU-S149的16S rDNA序列及其相似序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of YZU-S149 and its homologous sequences

3 结论与讨论

西瓜枯萎病是西瓜生产中最严重、影响最广泛的病害之一，是制约西瓜生产的的一种世界性土传真菌病害[21]。因此，对西瓜枯萎病的防治十分重要，生产上亟需解决的问题就是探索安全有效的防治方法。生物防治是利用微生物及其代谢产物防治植物病害，在保证经济效益的同时，环境污染也较小，具有很好的应用前景[22]。为了获得对西瓜枯萎病菌具有良好抑制作用的的生防细菌，本研究从对节白蜡的根部及根际筛选出3株对西瓜枯萎病菌具有显著抑制活性的内生菌株，具有广谱抑菌作用，表明其能产生抑菌活性较强的活性代谢产物，然而其产生的拮抗物质成分尚不明确，还需要进一步进行研究。

该研究筛选的3株细菌均能产生纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素，生防菌株可通过产生胞外酶降解病原菌的细胞壁，从而发挥生防作用[23]。铁元素是大多数微生物生存所必需的成分，因此，生防菌通过产生嗜铁素，大量吸收环境中的铁离子，最终导致病原菌因缺铁而失去致病能力[24]。芽孢杆菌是一类重要的生防菌株，已得到广泛开发和应用[25]。该研究选择对西瓜枯萎病盆栽防效最好的菌株YZU-S149进行鉴定，通过形态特征以及16S rDNA序列分析将其鉴定为枯草芽孢杆菌。目前用于西瓜枯萎病的生防细菌主要是芽孢杆菌属(Bacillusspp.)[26]。李丹等[10]筛选的2株解淀粉芽胞杆菌不仅对西瓜枯萎病菌具有良好的抑菌活性，还能够分解土壤中不能直接被植物吸收的物质，将其转化为植物可吸收的营养，从而促进植物生长。马利平等[27]分离的芽孢杆菌B96-Ⅱ不仅对西瓜枯萎病有较好的防效，对其他枯萎病有良好的防效。孙正祥等[28]分离的枯草芽孢杆菌XG-1具有促生作用，且有效定殖于西瓜根际与植株体内。该研究的菌株YZU-S149对西瓜枯萎病的室内盆栽防效为75.87%，优于百菌清500倍稀释液的施用效果，具有良好的开发与应用前景。

该研究从对节白蜡中分离和筛选了西瓜枯萎病的生防菌株，并测定了拮抗菌株的盆栽防效，下一步将继续测定其田间防效，以期为西瓜枯萎病的微生态制剂开发提供科学依据，实现药肥双减目标。