外源性硫化氢对颅脑创伤后应激障碍模型大鼠的神经保护作用及其对NF-κB/IκB调节机制研究

周卫　　胡晓华　　刘克洪　　王晓阳　　白弘照　　袁毅　　高刘传

[摘要] 目的 研究外源性硫化氫对颅脑创伤后应激障碍模型大鼠的神经保护作用及其对核因子Kappa B/抑制蛋白（NF-κB/IκB）调节机制。 方法 60只雄性SD大鼠简单随机化法分为对照组、模型组、低/中/高剂量硫化氢组，每组各12只。对照组常规管理，模型组构建PTSD动物模型。低剂量硫化氢组以幽闭电击法建立PTSD模型，电击前20 min给予1.68 mg/kg硫氢化钠（NaHS）腹腔注射处理;中剂量硫化氢组以幽闭电击法建立PTSD模型，电击前20 min给予3.20 mg/kg NaHS腹腔注射处理;高剂量硫化氢组以幽闭电击法建立PTSD模型，电击前20 min给予6.40 mg/kg NaHS腹腔注射处理。比较各组Morris水迷宫（MWM）评分、大鼠神经损伤严重缺损评分标准（NSS）评分、海马区细胞凋亡灰度值、NF-κB/IκB通路p65、pIκBα/IκBα表达情况，并观察各组海马区细胞形态学特征。 结果 模型组逃避潜伏期、NSS评分高于对照组，穿越平台位置次数、在原平台所在象限的时间占比低于对照组（P<0.05）;硫化氢组以上指标改善显著（P<0.05）;高剂量硫化氢组与对照组逃避潜伏期、穿越平台位置次数、在原平台所在象限的时间占比、NSS评分比较，差异无统计学意义（P>0.05）; 模型组海马区细胞凋亡灰度值高于其他各组（P<0.05）;硫化氢组灰度值改善显著（P<0.05）。模型组p65、pIκBα/IκBα高于对照组（P<0.05），硫化氢组改善明显（P<0.05）。 结论 外源性硫化氢对颅脑创伤后应激障碍模型大鼠具有神经保护作用，可减少海马区细胞的凋亡，抑制NF-κB/IκB通路表达，并呈现出剂量依赖性，NF-κB/IκB丰富生理功能为PTSD多靶点治疗提供了新思路。

[关键词] 颅脑创伤;神经保护;NF-κB/IκB;外源性硫化氢;应激障碍

[中图分类号] R563.8          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）11-0030-06

The neuroprotective effect of exogenous hydrogen sulfide on rats with post-traumatic stress disorder and the mechanism of its regulation on NF-κB/IκB

ZHOU Wei HU Xiaohua LIU Kehong WANG Xiaoyang   BAI Hongzhao   YUAN Yi   GAO Liuchuan

Department of Rehabilitation， Zhejiang Provincial Armed Police Corps Hospital， Hangzhou   310051， China

[Abstract] Objective To study the neuroprotective effect of exogenous hydrogen sulfide on rats with post-traumatic stress disorder and the mechanism of its regulation on nuclear factor Kappa B/inhibitory protein （NF-κB/IκB）. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into the control group， the model group， and the low/medium/high-dose hydrogen sulfide group，with 12 rats in each group. The control group was routinely managed， and the model group buildt PTSD animal models. The low-dose hydrogen sulfide group was treated with a claustrophobic electric shock to establish a PTSD model， and 1.68 mg/kg sodium hydrosulfide（NaHS） was injected intraperitoneally 20 minutes before the electric shock. The medium-dose hydrogen sulfide group was treated with a claustrophobic electric shock to establish a PTSD model， which was given 3.20 mg/kg NaHS intraperitoneal injection treatment 20 minutes before the electric shock. The high-dose hydrogen sulfide group was treated with claustrophobic shock method to establish PTSD model， and 6.40 mg/kg NaHS intraperitoneal injection treatment was given 20 minutes before the shock. The Morris water maze（MWM） scores， the scores of severe neurological deficits（NSS） scores， hippocampal cell apoptosis gray values，NF-κB/IκB pathway p65， pIκBα/IκBα expression in each group were compared. The hippocampus cell morphology characteristics in each group were compared. Results The escape latency and NSS scores of the model group were higher than those of the control group. The number of crossing the platform and the proportion of time in the quadrant of the original platform of the model group were lower than those of the control group（P<0.05）. The above indicators in the hydrogen sulfide group improved significantly（P<0.05）. There was no statistically significant difference between the hydrogen sulfide group and the control group in the escape latency， the number of crossing the platform position， the proportion of time in the quadrant where the original platform was located， and the NSS score（P>0.05）. The gray value of apoptosis in the hippocampus of the model group was higher than that of the other groups（P<0.05）. The gray value of the hydrogen sulfide group improved significantly（P<0.05）. The p65 and pIκBα/IκBα in the model group were higher than those in the control group（P<0.05）， and the hydrogen sulfide group improved significantly（P<0.05）. Conclusion Exogenous hydrogen sulfide has a neuroprotective effect on post-traumatic stress disorder model rats. It can reduce hippocampal cell apoptosis and inhibit the expression of NF-κB/IκB pathway in a dose-dependent manner.The abundant physiological functions of NF-κB /IκB provide new ideas for multi-target therapy of PTSD.

[Key words] Craniocerebral trauma; Neuroprotection; NF-κB/IκB; Exogenous hydrogen sulfide; Stress disorder

创伤后应激障碍（Post-traumatic stress disorder，PTSD）是由于个体遭受创伤或应激事件而导致的精神障碍，病程较长，可达数月或数年[1]。PTSD的临床治疗方法包括药物治疗与心理干预，其发生发展的生物学机制为临床研究的热点。国外科学家Goodwin在1989年首次检测到脑内游离硫化氢，能通过减少谷氨酸合成释放、抗氧化等调控神经系统，参与情绪、学习能力等调节。PTSD的主要临床表现为情绪异常以及学习能力的下降，因此有学者提出，可以尝试通过补充外源性硫化氢来提升PTSD的治疗效果。核因子Kappa B（NF-κB）及其抑制蛋白（Inhibition Kappa B，IκB）在机体多种细胞的生物学行为中均发挥重要的调节作用，但关于以上两者在PTSD中的作用尚无相关研究。本研究通过建立PTSD大鼠模型，从NF-κB/IκB信号的视角探讨了硫化氢对PTSD大鼠的神经保护作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验生物

研究对象为苏州大学实验动物中心提供的清洁级SD大鼠，共计60只，体质量200～300 g，平均体重（256.83±28.30）g，所有大鼠均在室温（25±2）℃的环境下自由摄食。动物许可证号SCXK（苏）20120005。

1.2 仪器及试剂

恒温孵育箱（山东欧莱博仪器有限公司，型号：DHP-9054B）;显微镜（OLYMPUS BX50，日本）;电泳仪（Light Cycler 480，美国）。p65、IκBα、ECL底物化学发光显色试剂盒;Lamin、pIκBα、βactin、IκBα、p65抗体;组织蛋白抽提试剂盒;聚丙烯酰胺凝胶;NaHS，试剂盒均购于上海远慕生物科技有限公司。

1.3 分組与造模

1.3.1 分组  随机将60只大鼠分为对照组、模型组、低/中/高剂量硫化氢组，每组各12只。对照组常规饲养，不进行任何其他操作。模型组以幽闭电击法建立PTSD模型;低剂量硫化氢组以幽闭电击法[4]建立PTSD模型。将大鼠置于密闭不透光的小电击箱中，箱子下部为可通过电流的不锈钢栅栏，栅栏与自制电刺激发生器相连。箱体的左右壁、后壁及顶壁由不透光树脂材料制成，箱体内固定一小型数码摄像头方便观察大鼠行为。电刺激发生器自行设计，可提供 0～10 mA 恒定电流刺激。实验前将大鼠置于箱中熟悉幽闭电击箱30 min。对照组放于箱中同样时间但是不予以刺激。大鼠处于无法逃避足部受到持续电流刺激的状态，刺激电流强度 8 mA，刺激时间10 s，刺激间隔随机，每次刺激 30 min。上下午各一次，间隔不少于4 h。连续3 d。电击结束大鼠仍放在原笼饲养。每个动物完成后用 75%酒精彻底清洁电击箱。低剂量硫化氢组电击前20 min给予1.68 mg/kg硫氢化钠（NaHS）腹腔注射处理;中剂量硫化氢组以幽闭电击法建立PTSD模型，电击前20 min给予3.20 mg/kg NaHS腹腔注射处理;高剂量硫化氢组以幽闭电击法建立PTSD模型，电击前20 min给予6.40 mg/kg NaHS腹腔注射处理。

1.3.2 PTSD大鼠模型建立  大鼠每日上午接受电击处理（电流8 mA、电压60 V），每次10 s，持续时间30 min，每次电击之间间隔3 s;6 h后重复以上电击操作。持续时间为7 d。

1.4 观察指标

1.4.1 各组神经功能指标比较  Morris水迷宫（Morris water maze，MWM）[2]评分、大鼠神经损伤严重缺损评分标准（Neurological severity scores，NSS）[3]评分。MWM实验：将恒温游泳池（直径160 cm）设置为20℃，水深40 cm，站台高度20～35 cm，水平面高于池中平台1 cm，对大鼠进行定位巡航实验，记录大鼠逃避潜伏期、游泳轨迹，计算机系统分析大鼠穿越平台位置次数及在原平台所在象限的时间占比。训练时间为5 d。NSS评分方法：提鼠尾离开地面，高度为1尺，观察大鼠前肢状态并计分。0分：神经功能正常，行走正常，前肢对称性地伸向地面;1分：神经功能缺损，前肢屈曲，行走基本正常;2分：神经功能缺损严重，前肢内收，行走倾斜;3分：神经功能重度缺损，行走路径为圈状，前肢状态为内收;4分：神经功能基本丧失，无法行走，意识减退;5分：死亡。

1.4.2 观察各组海马区细胞形态学特征  随机各取3只大鼠，用10%水合氯醛麻醉大鼠，固定，显露颅骨，取适量海马区标本，制作石蜡切片（厚度为5 μm），进行HE染色，光学显微镜下观察海马区细胞形态学特征。

1.4.3 各组海马区细胞凋亡情况比较  取适量海马区组织，同1.4.2中方法。制作石蜡切片并进行HE染色，显微镜观察切片染色情况，应用Motic Image Advanced 3.2软件记录细胞凋亡灰度值。

1.4.4 各组NF-κB/IκB通路蛋白表达情况比较  按照4∶1的比例，于100℃环境下配置5×蛋白上样和缓冲液的混合溶液，于室温环境下进行5 min的充分变性处理。将100 μg蛋白分别添加到100 g/L、80 g/L浓缩胶的孔中，然后对其进行电泳处理，处理电压分别为80 V、110 V，处理电流均为200 mA，完成蛋白质到0.22 μm的PVDF膜上的转录。取1∶3000、1∶1000、1∶2000兔抗人p65、pIκBα/IκBα抗体，利用50 g/L完全脱脂纯牛奶在4℃环境下摇床过夜培养，分3次对膜进行冲洗，冲洗溶液选择TBST溶液洗膜，每次冲洗时间为5 min，进一步标定处理后，对其蛋白吸光度值进行分析，分析软件采用最新版本的Odyssey。

1.5 统计学方法

应用SPSS 22.0统计学软件处理数据，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两组之间的比较采用LSD-t检验。组间计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组神经功能指标比较

高剂量硫化氢组、中剂量硫化氢组、低剂量硫化氢组、模型组、对照组间的各指标比较，差异有统计学意义（P<0.05）;LSD-t检验结果显示，模型组逃避潜伏期、NSS评分显著高于对照组（P<0.05）;模型组的穿越平台位置次数、在原平台所在象限的时间占比显著低于对照组（P<0.05）;高剂量硫化氢组、中剂量硫化氢组、低剂量硫化氢组的逃避潜伏期、NSS评分均显著低于模型组（P<0.05）;高剂量硫化氢组、中剂量硫化氢组、低剂量硫化氢组的穿越平台位置次数、在原平台所在象限的时间占比均显著高于模型组（P<0.05），且3组硫化氢剂量越高，以上指标改善越明顯（P<0.05）;高剂量硫化氢组与对照组逃避潜伏期、穿越平台位置次数、在原平台所在象限的时间占比、NSS评分比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 各组海马区细胞形态学

对照组海马区细胞的细胞核大而圆，核仁明显，染色浅，细胞排列紧密。模型组海马区细胞染色深浅不一，细胞体积较小，排列疏松，可见神经元变性的现象。低剂量硫化氢组的海马区观察结果显示，神经元数目有减少的现象，细胞间排列略显紊乱。中剂量硫化氢组的海马区观察结果显示，神经元受损情况明显，细胞排列大致正常。高剂量组可见紧密而整齐的细胞排列，细胞核边界清晰。

2.3 各组海马区细胞凋亡情况比较

高剂量硫化氢组、中剂量硫化氢组、低剂量硫化氢组、模型组、对照组，组间的海马区细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组细胞凋亡灰度值最高。

2.4 各组NF-κB/IκB通路表达比较

对照组、模型组、高剂量硫化氢组、中剂量硫化氢组、低剂量硫化氢组的p65的表达水平分别为（0.31±0.04）、（1.68±0.04）、（0.30±0.02）、（0.67±0.03）、（1.04±0.05），组间比较，差异有统计学意义（F=55.236，P<0.05）。对照组、模型组、高剂量硫化氢组、中剂量硫化氢组、低剂量硫化氢组的pIκBα/IκBα值分别为（0.07±0.02）、（2.13±0.09）、（0.10±0.02）、（0.22±0.03）、（0.55±0.07），组间比较，差异有统计学意义（F=44.023，P<0.05）。模型组的表达水平最高。

3 讨论

硫化氢在哺乳动物体内广泛存在，是一种气态细胞间信号转导因子。神经系统中硫化氢由神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞产生，呈游离状态，能特异性与三磷酸腺苷敏感钾通道作用，具有降低神经元兴奋性作用，且可利用胱硫醚-γ-裂解酶（CSE），而CSE分布具有特异性，主要存在于中枢神经系统，提示在中枢中可能有定位的硫化氢区域[4-6]。国外相关资料指出，硫化氢能通过环状核苷酸途径促进海马长期增益效应，从而增强认知，提高学习记忆能力[7-8]。且以往报道显示，硫化氢能通过增加离子型谷氨酸受体调节海马依赖情景型恐惧记忆[9-11]。崔永华等[12]发现，硫化氢能改善蛛网膜下腔出血后急性脑血管痉挛。本研究以NaHS腹腔注射，进入血液后可快速发生反应，补充外源性硫化氢，结果显示模型组的神经功能各评价指标值均与对照组存在明显的差异。说明PTSD大鼠存在显著的神经功能受损情况，也提示硫化氢对PTSD大鼠具有神经保护作用。

海马是机体调节应激反应的重要中枢[13-15]，研究发现，当应激反应发生时，海马区较容易受到损伤，对PTSE患者的认知及情绪均产生重要的影响[16-20]。陈旺等[21]在研究中发现，PTSE大鼠的海马区域细胞排列紊乱，神经元数量较少。本研究中，PTSE大鼠的海马区细胞排列及状态、染色情况、神经元等均与对照组差异明显，而经硫化氢处理后，以上状况明显改善。证实了硫化氢对海马区细胞的保护作用。殷莉等发现[22]，PTSD患者的海马体积变化与海马区神经元的凋亡情况密切相关。本研究结果也显示，模型组大鼠海马区细胞凋亡情况最为明显，而经过硫化氢处理后，减少了PTSD大鼠海马区细胞的凋亡，且在一定范围内，硫化氢剂量越高，效果越佳，这亦是其神经保护机制之一。

NF-κB/IκB通路参与机体炎症、细胞凋亡等多种病理生理过程[23-25]，NF-κB与IκB通常以复合物形式存在，当受到外在因素刺激时，可发生磷酸化，从而发挥调控细胞凋亡、炎症、免疫等过程[26-29]。PTSD的发生发展涉及多种病理机制，较为复杂。陶晓刚等[30-31]在研究中分析了颅脑创伤大鼠脑组织中NF-κB蛋白的表达情况，研究结果显示，NF-κB蛋白水平表达异常。杨玺等[32]在研究中分析了创伤性脑损伤患者的p65蛋白表达情况，结果显示，其与脑损伤的程度密切相关。本研究发现，模型组p65、pIκBα/IκBα呈高表达状态，且硫化氢的处理能够降低p65、pIκBα/IκBα的表达水平，说明硫化氢可能通过抑制NF-κB/IκB通路的方式来实现PTSD的治疗。值得注意的是，本研究为避免硫化氢给药时间对结果的影响，硫化氢处理组NaHS均在电击前20 min腹腔注射，关于其在电击后注射对大鼠的神经保护作用、NF-κB/IκB通路影响是否与电击前20 min相同有待后续深入探讨。

综上所述，外源性硫化氢对颅脑创伤后应激障碍模型大鼠具有神经保护作用，可减少海马区细胞的凋亡，抑制NF-κB/IκB通路表达，并呈现出剂量依赖性，NF-κB/IκB丰富生理功能为PTSD多靶点治疗提供了新思路。

[参考文献]

[1] Altschuler EL.Post-traumatic stress disorder[J].N Engl J Med，2017，377（18）：1795-1796.

[2] 周娇娇，阙建宇，于雯雯，等.Morris水迷宫检测动物学习记忆水平的方法学[J].中国老年学杂志，2017，37（24）：6274-6277.

[3] 黄元平，吴新贵，叶晓雪，等.电针治疗对脑梗死大鼠的摄食、饮水及其神经功能缺损的影响[J].广西医科大学学报，2015，32（2）：189-192.

[4] Chrapusta A，Pachalska M，Wilkfrańczuk M，et al.Evaluation of the effectiveness of neurofeedback in the reduction of posttraumatic stress disorder （PTSD） in a patient following high-voltage electric shock with the use of ERPs[J].Ann Agric Environ Med，2015，22（3）：556-563.

[5] 金利，田蜜，刘晓宇，等.创伤后应激障碍对慢性不可预见性应激抑郁模型的影响[J].现代生物医学进展，2015， 15（3）：422-424.

[6] 高珊珊，陈硕，陈志武.金丝桃苷抗小鼠脑缺血再灌注损伤的硫化氢机制[J].安徽医科大学学报，2016，51（9）：1292-1296.

[7] Zheng Y，Yu B，Cruz LKDL，et al.Toward hydrogen sulfide based therapeutics：Critical drug delivery and developability issues[J].Med Res Rev，2018，38（1）：57-100.

[8] Sun Y，Huang Y，Yu W，et al.Sulfhydration-associated phosphodiesterase 5A dimerization mediates vasorelaxant effect of hydrogen sulfide[J].Oncotarget，2017，8（19）：31 888-31 900.

[9] Gao C，Chang P，Yang L，et al.Neuroprotective effects of hydrogen sulfide on sodium azide-induced oxidative stress in PC12 cells[J].Int J Mol Med，2018，41（1）：242-250.

[10] 蒋莉，张平，罗焱，等.硫化氢对慢性应激致大鼠海马神经损伤的保护作用及机制[J].中华行为医学与脑科学杂志，2016，25（1）：19-23.

[11] 刘红霞，潘虹，王华，等.杏仁核脑区硫化氢对创伤后应激障碍模型大鼠抑郁样行为的影响[J].中国病理生理杂志，2017，33（6）：988-992.

[12] 崔永华，汪洋，虞正权.硫化氢对蛛网膜下腔出血后急性腦血管痉挛的影响及其作用机制[J].中华神经医学杂志，2016，15（11）：1124-1129.

[13] Rossetti AC，Paladini MS，Colombo M，et al.Chronic stress exposure reduces parvalbumin expression in the rat hippocampus through an imbalance of redox mechanisms：Restorative effect of the antipsychotic lurasidone[J].Int J Neuropsychopharmacol，2018，21（9）：883-893.

[14] Li Y，Hou X，Wei D，et al.Long-term effects of acute stress on the prefrontal-limbic system in the healthy adult[J].Plos One，2017，12（1）：e0168 315.

[15] 闫帅，高崧淋，陈玉杰，等.创伤后应激障碍大鼠海马星形胶质细胞Bax的表达[J].河北联合大学学报（医学版），2016，18（6）：421-424.

[16] Gilpin NW，Weiner JL.Neurobiology of comorbid post-traumatic stress disorder and alcohol-use disorder[J].Genes Brain Behav，2017，16（1）：15-43.

[17] Rosso IM，Crowley DJ，Silveri MM，et al.Hippocampus glutamate and N-Acetyl aspartate markers of excitotoxic neuronal compromise in posttraumatic stress disorder[J].Neuropsychopharmacology，2017，42（8）：1698-1705.

[18] 张伟国，杜喆，杜惠莲.创伤后应激障碍大鼠海马中脑源性生长因子的表达变化[J].中风与神经疾病杂志，2016， 33（8）：715-718.

[19] Rangaprakash D，Deshpande G，Daniel TA，et al.Compromised hippocampus-striatum pathway as a potential imaging biomarker of mild-traumatic brain injury and posttraumatic stress disorder[J].Hum Brain Mapp，2017， 38（6）：2843-2864.

[20] Han F，Xiao B，Wen L.Loss of glial cells of the hippocampus in a rat model of post-traumatic stress disorder[J].Neurochem Res，2015，40（5）：942-951.

[21] 陈旺，李陈成，李森，等.复合刺激创伤后应激障碍模型大鼠重要脑区的病理变化[J].中国实验动物学报，2016， 24（1）：87-91.

[22] 殷莉，王孟阳，段发亮，等.吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂对PTSD大鼠行为学及海马区神经元凋亡和炎性因子的影响[J].中华行为医学与脑科学杂志，2016，25（6）：510-514.

[23] Ch′ng WC，Abd-Aziz N，Ong MH，et al.Human renal carcinoma cells respond to Newcastle disease virus infection through activation of the p38 MAPK/NF-κB/IκBα pathway[J].Cell Oncol（Dordr），2015，38（4）：279-288.

[24] Potoyan DA，Zheng W，Komives EA，et al.Molecular stripping in the NF-κB/IκB/DNA genetic regulatory network[J].Proc Natl Acad Sci USA，2015，113（1）：110-115.

[25] 付小金，刘旺华，李花健，等.脾补土方对脑缺血/再灌注损伤大鼠NF-κB和IκBα蛋白表达水平的影响[J].湖南中医药大学学报，2015，35（3）：5-8.

[26] Tsai CY，Li FC，Wu CH，et al.Sumoylation of IkB attenuates NF-kB-induced nitrosative stress at rostral ventrolateral medulla and cardiovascular depression in experimental brain death[J].J Biomed Sci，2016，23（1）：65.

[27] Pan X，Jiang B，Liu J，et al.STC1 promotes cell apoptosis via NF-κB phospho-P65 Ser536 in cervical cancer cells[J].Oncotarget，2017，8（28）：46 249-46 261.

[28] Carlson CG，Dole E，Stefanski C，et al.The effect of specific IKKβ inhibitors on the cytosolic expression of IκB-α and the nuclear expression of p65 in dystrophic （MDX） muscle[J].Am J Transl Res，2015，7（4）：670-682.

[29] Majidinia M，Alizadeh E，Yousefi B，et al.Co-inhibition of notch and NF-κB signaling pathway decreases proliferation through downregulating IκB-α and Hes-1 expression in human ovarian cancer OVCAR-3 cells[J].Drug Res，2017，67（1）：13-19.

[30] 陶晓刚，刘佰运，陈学涛，等.PJ34在创伤性颅脑损伤中保护作用的实验研究[J].中华神经外科杂志，2015， 31（1）：66-70.

[31] 何珍，鄭伟华，欧维琳，等.水通道蛋白4和P65在肠道病毒71型感染合并神经源性肺水肿脑与肺组织的表达及意义[J].广东医学，2016，37（13）：1957-1960.

[32] 杨玺，史忠，李军，等.星状神经节阻滞对TBI患者早期应激和炎症反应的影响[J].中国急救医学，2016，36（10）：931-935.

（收稿日期：2020-10-26）