UPLC波长切换法同时测定脑安颗粒中9种化学成分的含量及其化学模式识别分析

郭焱

盐城市食品药品监督检验中心，江苏 盐城 224000

脑安颗粒具有活血化瘀、益气通络的功效，主要用于脑血栓形成急性期、恢复期气虚血瘀证候者的治疗，该中药复方制剂由川芎、当归、红花、人参、冰片5味中药加工而成，收载于《国家药品标准·新药转正》第34册[1]。方中君药川芎为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎，具有抑制血小板聚集、改善冠状动脉血流量、抗缺血再灌注损伤、降低血管阻力等作用，与臣药当归同属一科，两者均以苯酞类为主的挥发油类成分为主要活性成分，具有相似的化学成分，还含有有机酸类、生物碱类等成分[2-4]。红花为佐药，其药效成分羟基红花黄色素A能有效改善患者神经功能缺损程度，促进急性脑梗死患者的康复[5-6]。《国家药品标准·新药转正》第34册采用薄层荧光扫描法对脑安颗粒中人参皂苷Re做定量测定，此方法操作烦琐、误差较大，且难以全面评价药品质量。参考文献[7]采用超高效液相色谱法(UPLC)测定脑安颗粒中的多种人参皂苷成分，但尚未有采用UPLC同时定量测定脑安颗粒中其他多种成分的文献报道。为了全面评价脑安颗粒的质量，完善其质量评价标准，本研究采用UPLC波长切换法对其中洋川芎内酯 A、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、川芎嗪、绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、羟基红花黄色素A 9种指标成分进行含量测定，为进一步的临床研究提供参考。

1 材料

Waters ACQUITY型超高效液相色谱仪，包括真空脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱、2998型二极管阵列检测器、Empower 2.0工作站；AUW-220D型电子天平(d=0.01 mg，美国岛津公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山超声波仪器有限公司，功率：500 W，频率：50 kHz)。

对照品阿魏酸(批号：110773-201915，纯度：99.4%)、绿原酸(批号：110753-201817，纯度：96.8%)、盐酸川芎嗪(批号：110817-201608，纯度：83.4%)、藁本内酯(批号：111737-201910，纯度：100.0%)、羟基红花黄色素A(批号：111637-201810，纯度：93.1%)均购自中国食品药品检定研究院；洋川芎内酯 A(批号：CHB170817)、洋川芎内酯Ⅰ(批号：CHB161125)、洋川芎内酯 H(批号：CHB171229)、阿魏酸松柏酯(批号：CHB170912)、川芎嗪(批号：CHB180627)均购于上海纯优生物科技有限公司，纯度均≥98.0%；甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

脑安颗粒购自药店，共收集到3个厂家13个批次的样品，规格：1.2 g/袋，产品信息见表1。

表1 13批脑安颗粒样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相：乙腈(A)-0.4%冰醋酸溶液(B)，梯度洗脱(0～12 min，5%～10%A；12～15 min，10%～38%A；15～22 min，38%～55%A；22～25 min，55%～5%A；流速：0.3 mL·min-1；检测波长：0～8 min，285 nm(绿原酸、川芎嗪)；8～10 min，320 nm(阿魏酸)；10～12 min，304 nm(羟基红花黄色素A)；12～19 min，285 nm(洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A)；19～25 min，320 nm(藁本内酯)[8-11]；柱温：30 ℃；进样量：2 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备 精密称取洋川芎内酯A、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、川芎嗪、绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羟基红花黄色素A和藁本内酯对照品各适量，加55%甲醇超声处理溶解后制成质量浓度分别为0.206 7、0.200 2、0.193 7、0.081 6、0.138 9、0.126 3、0.145 1、0.124 7、0.342 4 mg·mL-1的混合对照品储备液，置冰箱冷藏避光保存，备用。

2.2.2供试品溶液的制备 取装量差异项下的脑安颗粒，研匀，取约1.0 g，精密称定，置50 mL棕色量瓶中，加入55%甲醇约30 mL，30 ℃超声处理(功率：500 W，频率：50 kHz)45 min，放冷至室温，再用55%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，冷藏避光保存。

2.2.3阴性供试品溶液的制备 按照脑安颗粒处方工艺分别制备缺川芎、当归、红花的阴性样品，依照2.2.2项下供试品溶液制备方法处理，即得阴性供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1系统适用性试验 分别精密吸取2.2项下的供试品溶液、混合对照品溶液、阴性供试品溶液、空白溶剂各2 μL，按2.1项下色谱条件测定，结果理论板数均大于9800，9种成分与相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，拖尾因子均小于1.15，空白溶剂与阴性供试品溶液中的其他成分对9种成分的测定无干扰，说明该色谱系统专属性较好。色谱图见图1。

注：A.混合对照品；B.样品；C.缺川芎、当归阴性样品；D.缺红花阴性样品；1.绿原酸；2.川芎嗪；3.阿魏酸；4.羟基红花黄色素A；5.洋川芎内酯Ⅰ；6.洋川芎内酯H；7.阿魏酸松柏酯；8.洋川芎内酯A；9.藁苯内酯。图1 对照品、阴性样品及脑安颗粒溶液UPLC图

2.3.2线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分别置20 mL量瓶中，加55%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液。取上述系列混合对照品溶液和混合对照品储备液，设置进样体积为2 μL，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图。以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，绘制各组分回归曲线，计算相应回归方程

和相关系数(r)。结果表明，洋川芎内酯A、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、川芎嗪、绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羟基红花黄色素A和藁本内酯在实验范围内呈良好的线性关系。将对照品溶液逐级稀释后，以信噪比S/N=10时的质量浓度为各成分的定量限(LOQ)，结果见表2。

表2 脑安颗粒9种有效成分的线性范围

2.3.3精密度试验 取混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图并计算9种成分峰面积的RSD。结果洋川芎内酯A、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、川芎嗪、绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羟基红花黄色素A和藁本内酯峰面积RSD(n=6)分别为1.03%、0.86%、0.72%、0.65%、0.88%、0.91%、0.58%、1.11%、0.94%，表明仪器精密度良好。

2.3.4稳定性试验 取同一供试品溶液(S4)，分别于制备后0、4、8、12、16、20、24 h按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图并计算9种成分峰面积的RSD。结果洋川芎内酯A、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、川芎嗪、绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羟基红花黄色素A和藁本内酯峰面积的RSD(n=7)分别为1.08%、1.02%、0.79%、0.88%、0.91%、0.67%、0.83%、0.81%、0.98%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.5重复性试验 取同一批供试品(S4)6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图及峰面积，按2.3.2项下回归方程计算9种成分的含量及其RSD。结果洋川芎内酯A、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、川芎嗪、绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羟基红花黄色素A和藁本内酯平均质量分数分别为0.297 8、0.261 3、0.258 8、0.110 9、0.361 7、0.302 1、0.215 4、0.197 2、1.115 3 mg·g-1，RSD(n=6)分别为1.07%、1.13%、0.98%、0.89%、1.01%、0.75%、0.85%、0.69%、0.93%，表明该方法重复性良好。

2.3.6加样回收率试验 精密称取已知含量的供试品(S4)6份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入洋川芎内酯A、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、川芎嗪、绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羟基红花黄色素A和藁本内酯混合对照品溶液(质量浓度分别为101.3、89.2、87.3、37.53、123.2、103.4、74.13、67.27、117.07 μg·mL-1)1.50 mL，按2.2.2项下供试品溶液制备方法处理，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图，计算各成分加样回收率及相应RSD。结果洋川芎内酯A、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、川芎嗪、绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羟基红花黄色素A和藁本内酯平均加样回收率及RSD分别为100.01%(RSD为0.75%)、99.57%(RSD为0.62%)、99.21%(RSD为0.53%)、99.35%(RSD为1.10%)、99.94%(RSD为0.65%)、99.84%(RSD为1.11%)、98.70%(RSD为0.56%)、99.59%(RSD为0.78%)、99.26%(RSD为1.03%)，结果见表3。

表3 脑安颗粒9种成分的加样回收率试验结果

续表3

2.4 样品含量测定

取供试品13批，分别按照2.2.2项下条件制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件平行进样3针，记录色谱图及峰面积，按2.3.2项下回归方程计算9种活性成分含量，结果见表4。

表4 脑安颗粒中9种成分含量测定结果 mg·g-1

2.5 化学模式识别分析

将13批脑安颗粒含量测定结果输入SPSS 22.0软件和SIMCA 14.0软件进行聚类分析和主成分分析。

2.5.1聚类分析 系统聚类分析是根据测定样品的数据，将研究对象划分为不同类别，类别内的研究对象有相似特点，类别间的对象则有所不同的一种多元统计分析方法[12-13]。利用 SPSS 22.0软件，采用利差平方和法(Ward 法)，以欧式距离平方为样品测度，对13批样品进行聚类分析。分析发现，当欧式距离为5时，13批样品被分成了3类：S1、S2、S3、S4、S5为第I类，S6、S7、S8、S9、S10为第Ⅱ类，S11、S12、S13为第Ⅲ类。第I类均为河南省百泉制药有限公司产品，第Ⅱ类全部为上海祥鹤药业有限公司产品，第Ⅲ类全部为辽源誉隆亚东药业有限责任公司产品。说明同一厂家产品质量具有较高的稳定性，不同厂家的样品之间存在一定差异。聚类分析树状图见图2。

图2 13批脑安颗粒聚类分析树状图

2.5.2主成分分析及药物质量评价 以13批脑安颗粒中的9个成分含量为指标建立数据集，输入SPSS 22.0软件，运用因子分析中的主成分分析处理，提取累积方差贡献率>85%的因子[14-18](A1、A2、A3)作为主成分，其中A1特征值为5.718，方差贡献率为62.421%，A2特征值为1.469，方差贡献率为16.327%，A3特征值为1.227，方差贡献率为13.633%。3个主成分的相关系数矩阵及因子得分矩阵见表4～5。由表4可知，川芎嗪、绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯和藁本内酯之间均具有较大的正相关性。由表5因子得分矩阵可知，洋川芎内酯 Ⅰ、绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、藁本内酯对主成分A1贡献较大，洋川芎内酯 A和洋川芎内酯 H对主成分A2贡献较大，川芎嗪和羟基红花黄色素A对主成分A3贡献较大。

以每个主成分的特征值占累加特征值的百分比作为权重系数进行线性组合，可得到综合得分计算公式(1)。

F=0.624F1+0.163F2+0.136F3

(1)

F代表综合得分，F1、F2和F3分别代表3个主成得分，其中Fn=FACn×相应特征值的算术平方根(n代表1、2、3，FAC为主成分的因子得分系数)，结果见表6。综合得分越高，说明以9个有效成分为指标的脑安颗粒质量越好。由表7可知，上海祥鹤药业有限公司生产的产品质量较好。

表5 脑安颗粒中9种成分相关系数矩阵

表6 脑安颗粒中9种成分因子得分矩阵

表7 13批脑安颗粒主成分得分、综合得分及排序

3 讨论

3.1 方法学条件

研究过程中，采用二极管阵列检测器(PAD)在190～400 nm全波长进行筛选；考察了不同比例和梯度的流动相系统(甲醇、乙腈、水、0.2%磷酸、0.4%冰醋酸、0.5%甲酸)对色谱峰的影响；对柱温(25、30、35 ℃)、提取溶剂(甲醇、乙醇、75%甲醇、75%乙醇、55%甲醇、55%乙醇)、提取方式(超声、浸渍过夜、回流)、提取时间(35、45、55 min)、超声频率及超声功率都进行考察。通过上述研究，最终选择分段变换波长检测法对9种化学成分进行测定并优化得到了本研究所需的色谱条件。

3.2 液相色谱仪的考察

本实验分别考察高效液相色谱仪和超高效液相色谱仪对脑安颗粒的分析，结果UPLC相较HPLC不仅大大缩短了分析时间(由80 min缩短到25 min)，而且各主要成分的分离效果更好，能满足系统适用性试验的要求，灵敏度和专属性更强，测定结果准确、可靠。

3.3 聚类分析和主成分分析

主成分分析是对复杂信息的多维变量进行提取及数学降维，生成新的综合变量的相互独立的方法，生成的综合变量即是主成分。主成分分析法在不损失大量信息的前提下，将高维数据转换成低维数据，便于观察药物之间的差异性，特别适用于中药多成分的综合质量评价分析。本研究对13批脑安颗粒样品中的9种成分含量测定数据进行聚类分析和主成分分析，两者分析结果一致，13批样品的9个成分含量存在一定差异，被分为3大类，可以很好识别不同生产厂家的样品。

中药复方制剂成分复杂，往往是多种药效成分协同作用，故多组分含量同时测定更能客观全面反映中药制剂的质量。本研究建立UPLC同时测量脑安颗粒中的洋川芎内酯A、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、川芎嗪、绿原酸、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、羟基红花黄色素A和藁本内酯9种成分的含量，与HPLC相比大大缩短了分析时间，且精密度、稳定性、重复性、加样回收率均符合方法学要求，可为脑安颗粒药品质量评价提供参考。