基于网络药理学的丹参治疗视网膜静脉阻塞作用机制研究△

2021-07-06刘自强农璐琪韩梦雨訾迎新孟欢邓宇邓婷婷金明

中国现代中药 2021年5期

刘自强，农璐琪，韩梦雨，訾迎新，孟欢，邓宇，邓婷婷，金明*

1.北京中医药大学，北京 102488；2.中日友好医院眼科，北京 100029

视网膜静脉阻塞(RVO)是指视网膜静脉血液循环发生障碍，引起视网膜相应区域出血、渗出及水肿的眼病[1]，其并发症黄斑水肿能引起患者视力下降甚至导致失明。RVO症状与中医“暴盲”“视瞻昏渺”类似。目前多数医家认为，RVO主要是由各种原因导致的脉络瘀阻、血行不畅而溢于脉外、遮蔽神光所致[2]。

丹参为植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的根及根茎，其主要功效为活血祛瘀、止痛等，临床上常用于治疗胸痹心痛、脘腹胁痛、症瘕积聚、月经不调等疾病[3-4]。丹参目前是眼科临床上常用的活血化瘀药，对RVO有一定的治疗作用。樊曦等[5]研究发现，丹参联合三七口服给药后，可明显降低RVO模型大鼠血小板黏附率，预防视网膜静脉血栓形成。以丹参为主要成分的中成药复方血栓通胶囊[6]、丹红化瘀口服液[7]等也已被证实对RVO有一定治疗作用。相关研究发现，使用丹参酮ⅡA磺酸钠注射液能有改善效视网膜中央静脉阻塞患者的临床症状和血液流变学相关指标[8-9]。张锡钢等[10]研究发现，使用丹参注射液离子导入治疗早期RVO患者可提高临床疗效。然而，目前丹参治疗RVO的作用机制尚不明确，且中药有效成分复杂，仅通过动物实验等探究其作用机制存在一定的困难。

网络药理学以多学科为基础，阐明药物治疗疾病的作用靶点和信号通路，这与中药多成分、多靶点治疗疾病类似[11-12]。因此，本研究通过筛选丹参的有效成分及相关疾病靶点，获得丹参和RVO的交集靶点，构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络和“药物-有效成分-疾病-靶点”网络，进行生物学过程和通路分析，以期为临床使用丹参治疗RVO提供参考。

1 材料与方法

1.1 丹参有效成分及靶点的获取与筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)[13]检索丹参的有效成分，以药物口服生物利用度(OB)>30%、类药性(DL)>0.18及口服药物Caco-2细胞渗透率>0.4作为筛选条件，获得丹参的主要有效成分及其相关靶点。

1.2 疾病相关靶点的获取

应用GeneCards数据库(https：//www. genecards. org/)，以“retinal vein occlusion”为关键词进行检索，获得RVO相关的疾病靶点。将丹参有效成分靶点和RVO靶点取交集，并制作韦恩图。

1.3 PPI网络的构建

在STRING 11.0数据库(https：//string-db.org)构建丹参活性成分靶蛋白和RVO相关靶蛋白的PPI网络图。

1.4 药物-活性成分-疾病-靶点相互作用网络的构建

应用Cytoscape 3.7.2软件分析数据，构建药物-活性成分-疾病-靶点相互作用网络。

1.5 富集分析

采用ClusterProfiler R软件对丹参治疗RVO的作用靶点进行基因本体(GO)注释分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析[14]，探讨丹参有效化学成分治疗RVO的作用机制。

2 结果

2.1 丹参有效成分

在TCSMP数据库中，将丹参有效成分按OB、DL及Caco-2细胞渗透率条件进行筛选后，最终得出41个有效成分，分别是丹参酮ⅡA、异丹参酮Ⅱ、丹参新醌等，见表1。获得丹参有效成分对应靶点70个。

2.2 疾病靶点

通过GeneCards数据库进行检索，获得RVO的疾病靶点1705个，与丹参有效成分靶点的交集靶点46个，使用ClusterProfiler R软件绘制疾病靶点与药物成分靶点韦恩图，见图1。

2.3 PPI网络

通过STRING 11.0数据库构建构建丹参活性成分靶点和RVO相关靶点的PPI网络，见图2。

图2 丹参与RVO靶点的PPI网络

2.4 药物-活性成分-疾病-靶点相互作用网络

使用Cytoscape 3.7.2软件绘制丹参治疗RVO的药物-活性成分-疾病-靶点相互作用网络，见图3。在该网络中，共包含节点83个，其中丹参、RVO节点各1个，丹参有效成分节点35个(表1内41个丹参有效成分中，有6个成分无对应的RVO靶点)，丹参治疗RVO的潜在作用靶点46个，含边354条。其中丹参酮ⅡA、异丹参酮Ⅱ等成分相关的节点数较多，是丹参的主要有效成分。

注：红色代表RVO；绿色代表丹参；黄色代表丹参治疗RVO有效成分；蓝色代表交集靶点。图3 丹参治疗RVO的药物-活性成分-疾病-靶点网络

2.5 GO功能富集分析

通过ClusterProfiler R软件对上述获得的46个关键靶点进行GO注释分析，丹参治疗RVO的主要富集过程包括核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体、G蛋白偶联胺受体活性、激活转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、核转录因子-κB(NF-κB)结合、血红素结合、铵离子结合、DNA结合转录激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性、四吡咯结合、酰胺结合、氧化还原酶活性、类固醇结合、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节活性、肽结合、肾上腺素能受体活性、神经递质结合等。其中关键靶点(前20位)见图4。

图4 丹参治疗RVO靶点的GO富集分析(前20位)

2.6 KEGG通路富集分析

借助ClusterProfiler R软件对丹参与RVO的共同靶点进行KEGG通路富集分析，筛选出作用通路共76条，包括乙型肝炎、麻疹、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、白细胞介素-17(IL-17)信号通路、内分泌抵抗、催乳素信号途径、丙型肝炎、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路、人巨细胞病毒感染、细胞凋亡、肿瘤坏死因子信号途径、弓形虫病、磷脂腺肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、人T细胞白血病病毒1型感染、利什曼病、糖尿病并发症中的糖基化终末产物-糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路、Th17细胞分化、多种凋亡、胆碱能突触等相关。其中最为显著的20条代谢通路见图5。

图5 丹参治疗RVO靶点的KEGG富集分析(前20位)

3 讨论

RVO多发生于中老年患者，目前发病机制不完全明确，致使其发生的因素有年龄增长、高血压、糖尿病、血脂异常、心血管疾病等[15]，并发症黄斑水肿是引起视力受损的主要原因。中医认为RVO的病因病机复杂，其发生的根本原因在于脉络瘀阻、血溢于脉外。早在《证治准绳·杂病·七窍门》中就已提及该病的发病机制，现代学者多认为血瘀是RVO的重要病理基础。李学晶等[16]认为，RVO基本病机为气虚血瘀。孟凡超等[17]认为瘀是RVO发病之关键，与气、火、痰交杂致病。

丹参作为中国传统中药，具有活血祛瘀、通经止痛之功效，而RVO患者正对此病机。本研究中TCMSP数据库检索结果和药物-有效成分-疾病-靶点网络分析结果显示，丹参酮ⅡA、异丹参酮Ⅱ、丹参新醌等化合物相关的节点数较多，是丹参的主要有效成分。其中，丹参酮ⅡA是目前研究的热点之一。杨敏[18]发现，丹参酮ⅡA能改善患者血液的纤溶及抗凝活性，降低全血比黏度等水平，从而改善凝血功能及相关血流变指标，血液黏稠度增高是RVO发生的主要危险因素。曹珊等[19]研究发现，丹参酮ⅡA可以降低患者血清中IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子水平，而上述炎性因子在RVO发生发展中发挥重要作用[20]。

丹参治疗RVO的PPI网络分析结果显示，46个靶蛋白中，节点度值排序前10位的依次为Fos、骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(MYC)、胱天蛋白酶3(CASP3)、雌激素受体1(ESR1)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、髓样β(A4)前体蛋白(APP)、细胞周期素1(CCND1)、Jun、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、网状内皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)，可能是丹参治疗RVO的关键靶点。其中PTGS2、STAT3的表达与炎症密切相关[21-22]，RELA在调控炎症的细胞信号系统/NF-κB信号通路中起着极其重要的作用[23]，炎性反应是RVO发生发展的重要环节。Fos、MYC在调控细胞生长、分裂、增殖等方面发挥重要作用，能促进组织的修复和再生，与改善凝血、微循环、血液流变学及血流动力学指标等密切相关[24]。CASP3参与细胞凋亡过程的调控。

本研究发现，丹参治疗RVO主要涉及81个生理过程和76条通路。KEGG结果显示，丹参的主要作用可能与细胞凋亡、TNF信号通路、IL-17信号通路等有关。TNF是机体抗炎和免疫调节的主要细胞因子之一，研究表明，RVO的产生及严重程度与房水或玻璃体液中TNF-α水平呈正相关[25]。Wang等[26]发现，TNF-α通过诱导基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达来参与RVO的发生。Yamawaki等[27]发现，TNF-α通过激活血管内皮生长因子来增强炎性反应，促进新生血管生成。IL-17是炎症反应的早期启动因子，IL-17与受体结合后，可通过促分裂原活化蛋白激酶途径和NF-κB途径发挥其抗炎作用[28]。Li等[29]研究认为，IL-17可能通过细胞骨架重塑、血管内皮生长因子等参与RVO新生血管形成。炎性反应和新生血管形成是RVO发生发展中最为重要的病理反应。

本研究的网络药理学分析也存在一定的局限性，首先，丹参有效化学成分的靶蛋白谱广，加之RVO病理机制复杂，如何通过数学计算在网络靶标的基础上准确找到丹参治疗RVO的多种靶蛋白及作用途径，值得进一步探索；其次，目前关于丹参、RVO的数据库信息及临床、实验数据的积累还有很大不足，同时缺乏对活性成分定量检测，故本次研究仅为预测性分析，后期应进行相关实验予以验证[11，30]；最后，网络药理学是将复杂生物系统间的相互作用抽象表达为网络，故还需要从理论和实际应用等方面深入理解丹参治疗RVO的内在调控机制[31]。