抗乙肝病毒药物对OH2溶瘤效果的影响

张思琪，谷相勇，刘滨磊*

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.武汉滨会生物科技股份有限公司)

肝癌作为一种常见的恶性肿瘤，其发病率在我国逐年上升[1]。有研究表明，乙型肝炎病毒作为诱发肝癌的最主要危险因素之一[2]，其所编码的乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)在很多肝癌中存在高表达趋势[3]。由于乙型肝炎相关的原发性肝癌患者体内通常同时携带乙肝病毒[4]，在临床治疗过程中，常采取在抗肿瘤治疗的同时给予抗乙肝病毒来改善患者肝功能，降低肝脏病毒载荷量，延长肝癌患者生存期[5]。富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)[6]、阿德福韦酯(Ade)、替比夫定(Telb)[7]是目前3种经常使用的核苷类抗乙肝病毒药，临床上广泛运用于乙肝相关的原发性肝癌患者的治疗。核苷类抗乙肝病毒药主要是通过抑制HBV逆转录，或是与HBV的DNA链竞争性结合，影响病毒复制，最终达到抗病毒的效果[8]。

Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒(oncolyticherps simplex virus Ⅱ，OH2)是在野生型单纯疱疹病毒株Ⅱ型的基础上通过基因编辑技术，在敲除神经毒性基因(ICP34.5)、删除免疫抑制基因(ICP47)的同时，在ICP34.5位点插入编码的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，hGM-CSF)基因序列，构造出的一种溶瘤病毒[9]。因其溶瘤活性强，靶向性好，能携带多种外源基因，又同时兼具安全性强等特点[10],从而引起溶瘤病毒相关研究人员强烈关注。在目前的临床试验中，OH2注射液的治疗效果及受试者对药物的耐受性均表现良好，且患者注射部位反应较小，安全性好[11]，具有很好的应用前景。但在临床对于乙型肝炎相关原发性肝癌的治疗过程中，患者通常需要同时服用抗乙肝病毒药物来延缓疾病的发展。本文旨在回答OH2作为一种改造后病毒，在对携带HBV肝癌患者的治疗上，其疗效是否会受到目前临床常见的3种抗乙肝病毒药物的影响，为OH2的肝癌治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物和细胞

正常BALB/c小鼠，6～8周龄，无基因改造及免疫缺陷。购自湖北省疾控中心。

CT26-iRFP细胞(本实验室提供)，是通过PiggyBac转座子系统将近红外荧光蛋白iRFP720转入鼠结肠癌细胞CT26细胞株，并通过嘌呤霉素筛选获得CT26-iRFP720单克隆细胞株[12]。

1.1.2 试剂与仪器

DME/F12培养基购自Hyclone公司。胎牛血清购自四季青公司。肌醇山梨醇缓冲液(IS Buffer)由本实验室配制。胰酶购自Gibco公司。OH2病毒是通过HG52野生病毒株的基因组中剔除ICP34.5和ICP47基因,并插入hGM-CSF表达序列的改造病毒[13](本实验室提供)重悬于IS Buffer并分装冻存在-70℃冰箱中，在使用前进行快速解冻。每一个时间点的研究所用病毒都是新鲜解冻。实验用病毒没有重复冻融。Ade、TDF片均购自湖北省中西医结合医院；Telb购自华中科技大学同济医学院附属同济医院。所有药物使用时均获得国药准字号，且在保质期内。

二氧化碳培养箱购于日本松下公司。细胞计数仪购于赛默飞科技有限公司。动物活体成像系统购于PE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 病毒准备

将按标准生产流程生产的1×108CCID50/mL的OH2病毒解冻后混合均匀，使用IS Buffer稀释到约1×107CCID50/mL，分装到EP管中冻存在-70℃冰箱中。

1.2.2 抗乙肝病毒药物准备

依照药物使用说明并根据人和鼠的体表面积比例计算小鼠每日给药量，即若将人的单日有效剂量记为A，小鼠单日有效剂量记为B，按小鼠(20g)体表面积是人(70kg)的0.0026倍，则小鼠单日需使用的剂量为B=0.0026×A。Telb人使用剂量为600mg/d，故小鼠注射剂量为1.56mg/100μL。Ade人使用剂量为10mg/d，故小鼠每日剂量为26μg/100μL，TDF人使用剂量为300mg/d，故小鼠注射剂量为780μg/100μL。将Telb、TDF用无菌PBS充分溶解，Ade加入少量无水酒精充分溶解，然后用无菌PBS分别将3种药物稀释到目的浓度，最终用0.22μm的滤头在生物安全柜中过滤除菌，分装到EP管中，放4℃避光保存。

1.2.3 CT26-iRFP细胞准备

从液氮中取出一只CT26-iRFP细胞复苏，使用含10%胎牛血清的DME/F12在37℃ 5%CO2培养箱中进行培养。细胞汇合度达到80%～90%进行细胞传代。待细胞达到80%～100%汇合度后收集培养瓶中的CT26-iRFP细胞，医用离心机820g离心5min，随后用无血清DME/F12重悬，并将细胞稀释到1×107个/mL。

1.2.4 小鼠皮下移植瘤诱导

22只雌性BALB/c小鼠于右侧腹部皮下注射100μL含有1×106CT26-iRFP鼠结肠癌细胞悬液以诱导肿瘤。成瘤后，分别量取肿瘤长径(a)、短径(b)，肿瘤体积(TV)的计算公式为：TV=1/2×a×b×b。

1.2.5 小鼠分组给药及量瘤

待肿瘤体积达到约80mm3时，将22只荷瘤鼠随机分为5组，每组4～5只，分别为阴性对照组(n=4)、OH2组(n=5)、OH2+Telb组(n=5)、OH2+Ade组(n=4)、OH2+TDF组(n=4)。第一次治疗记为第0d，治疗包括OH2病毒瘤内注射和抗乙肝病毒药物溶液腹腔注射。各治疗组的病毒剂量和注射体积一致，为1×106CCID50/100μL/只，阴性对照组瘤内注射病毒重悬用的肌醇山梨醇缓冲液(IS Buffer)100μL。同时，连续7d，各OH2+抗乙肝病毒药物组动物每日经腹腔注射100μL有效剂量的抗乙肝病毒药物PBS溶液，阴性对照组和OH2单药治疗组动物于腹腔注射等量PBS。动物皮下植瘤后第10d(平均瘤体积约80mm3)开始用OH2治疗，将第一次治疗记为第0d，于第0、4、7d共给药3次，实验观察时间为21d。在首次给药后通过测量肿瘤体积来对病毒抑瘤效果进行评估。

1.2.6 小鼠肿瘤近红外拍摄

在治疗后第21d，将各组动物分组放入动物活体成像系统，拍摄肿瘤近红外荧光表达图片，并记录同等面积下小鼠肿瘤的总荧光强度。

1.3 统计学方法

应用GraphPad Prism 6.01软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠量瘤结果

研究结果表明在CT26-iRFP皮下移植瘤模型上，与阴性对照比所有瘤内注射OH2的动物肿瘤生长趋势更为平缓(图1，封二)。给药第21d，与阴性对照组比较，3组治疗效果明显(图2，封二)：OH2组(P=0.0267)；OH2+Ade组(P=0.0071)；OH2+TDF组(P=0.0168)，且3组均有无瘤动物产生，但3个有效组之间疗效无统计学差异(P>0.05)。停药一段时间后，3个有效组的肿瘤治疗效果未见明显反弹。OH2+Telb组与阴性对照组相比较抑瘤效果无显著性差异(P=0.3105)。

2.2 小鼠肿瘤总荧光强度结果

在实验第21d对各组小鼠分别进行近红外荧光强度检测。结果表明在CT26-iRFP皮下移植瘤模型上，小鼠肿瘤总荧光强度与量瘤数据的趋势基本一致(图3，封三)，已有两只动物iRFP信号消失，且出现一只无瘤动物。其中OH2+Ade(P=0.0092)；OH2+TDF(P=0.0313)。OH2组虽与阴性对照组相比未见显著性差异(P=0.0888)，但阴性对照组的肿瘤总荧光强度约为OH2组的两倍(6.61×109±2.33×109vs 1.28×1010±1.96×109)，OH2+Telb组和阴性对照组相比在肿瘤总荧光强度方面未见显著性差异，OH2+Telb组荧光强度为(1.07×1010±1.52×109)，阴性对照组为(1.28×1010±1.96×109)。见图4(封三)。

3 讨 论

溶瘤病毒作为一种目前新兴的抗肿瘤生物治疗技术受到了众多研究者的关注和肿瘤患者的期待[14]。但对于同时携带HBV的肿瘤患者来说，他们日常服用的抗病毒药物是否会对溶瘤病毒的治疗效果产生抑制作用，不单是研究者们需要考虑的问题，更是溶瘤病毒普适性的一种体现。

本文针对在腹腔分别注射Ade、TDF、Telb的情况下，溶瘤病毒OH2对CT26-iRFP肿瘤进行瘤内给药的治疗效果进行实验，评估OH2在3种常见抗HBV药物的作用下的溶瘤情况。实验结果表明，OH2+Ade组和OH2+TDF组的OH2对小鼠肿瘤有明显的治疗效果，且与OH2组的肿瘤大小无显著性差异，甚至在肿瘤荧光强度上的数值更小。因此，我们认为OH2组对肿瘤依然有很好的治疗作用，可能是由于样本数量较少，另外两只小鼠肿瘤荧光强度过高导致两组间对比无差异。我们可以认为在本次试验中Ade和TDF对OH2的溶瘤效果没有影响。OH2+Telb组在第3次给药结束后的一周时间里，肿瘤生长的速率低于阴性对照组，但相比OH2组其生长速率还是处于一个较快的趋势。在随后的一周时间内，OH2+Telb组小鼠的肿瘤快速增长，其生长速率接近阴性对照组，但即使在这种情况下，在实验结束时OH2+Telb组的肿瘤体积仍小于阴性对照组。我们认为，Telb对OH2的治疗效果存在影响，且很有可能是通过中断OH2在肿瘤中的持续性复制，或影响OH2中hGM-CSF的表达削弱了抗肿瘤免疫反应，从而导致在OH2治疗后期，肿瘤的增长速率变快，最终未达到理想的抗肿瘤效果。

综上所述，OH2+Ade组和OH2+TDF组对OH2的溶瘤效果影响小，更适合推荐给参与OH2抗肿瘤治疗临床试验的HBV携带者使用，以减少抗乙肝病毒药物对OH2治疗效果的干扰。