二甲双胍对高脂小鼠颈动脉及肝脏内脂肪沉积的影响*

姜 悦，代圣洁，姜志龙，马雪芹，张又枝

(湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种多病因但几乎无长期过量饮酒史的慢性肝脏疾病,主要临床表现为肝脏脂质异常蓄积和脂肪细胞的变性[1]。NAFLD与代谢综合征(metabolic syndrome,MetS)、2型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)、动脉硬化性心血管疾病的高发密切相关。虽然NAFLD不是代谢综合征的一个组分，但研究表明其与心血管疾病例如动脉粥样硬化的发生高度相关[2]。

二甲双胍(metformin)是植物法国丁香的提取物，属于双胍类抗高血糖药，可以降低空腹血糖[3]。自1957年被发现，已经在临床中应用了半个世纪，在我国也已有近20年的使用史[4]。二甲双胍外用药可以有效预防由前期糖尿病原因引起的各种临床并发症，降低患者血浆中的胰岛素胆固醇水平，从而减少对胰岛素的抵抗，所以是临床上治疗Ⅱ型糖尿病最常用的药。有文献[5]报道二甲双胍除了降糖作用，还具有抗肿瘤、抗炎及抗衰老作用，也有研究[6]表明二甲双胍对血管及心脏有保护作用、对多囊卵巢有治疗作用，可明显改善NAFLD患者的肝脏病理状态，使其血脂水平降低和磷酸转氨酶水平下降。但还没有研究表明二甲双胍对颈部动脉粥样硬化合并NAFLD小鼠的作用。因此，我们在ApoE基因敲除小鼠中形成腹主动脉动脉粥样硬化和NAFLD，再通过颈总动脉部分结扎(partial carotid ligation,PCL)手术形成颈部动脉粥样硬化，观察二甲双胍对颈部动脉斑块合并NAFLD小鼠的肝脏脂肪病变是否有改善作用。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

盐酸二甲双胍(阿拉丁，5g，M107827)；苏木素染液(武汉塞维尔生物科技有限公司，100mL，G1004-100)；伊红染液(武汉塞维尔生物科技有限公司，100mL,G1001-100)；高脂饲料。

1.2 实验动物及分组

雄性ApoE基因敲除小鼠20只(22～25g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)；分为4组，具体分组和给药途径如下。

高脂对照组(Con组)：5只，每天给予高脂饲料。

二甲双胍组(Met组)：5只，每天二甲双胍灌胃300mg/kg，并给予高脂饲料。

PCL手术组(PCL组)：5只，给予高脂饲料14d后，并对左侧颈总动脉(LCA)进行PCL手术。

PCL+二甲双胍组(PCL+Met组)：5只，给予高脂饲料，灌胃二甲双胍(300mg/kg，1次/d)14d后，做PCL手术，手术后继续灌胃二甲双胍(300mg/kg，1次/d)至实验结束。

1.3 实验方法及检测指标

记录小鼠体重的变化及饲料的消耗情况，于小鼠饲养7周后眼球取血，处死，解剖并取颈动脉血管和肝脏组织，置于4%多聚甲醛的EP(10mL)管中固定，采用油红O和苏木素-伊红(HE)染色法检测小鼠颈动脉血管和肝脏组织结构的变化，显微镜下观察拍照。

非酒精性脂肪性肝病的病理组织学诊断参考2010年中华医学会肝脏病学会脂肪肝和酒精性肝病学组修订的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》，具体计分见表1。

表1 非酒精性脂肪性肝病变性程度计分表

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 各组小鼠手术后7周体重的变化

首先观察各组小鼠精神状态和体重改变情况。如图1所示，与Con组相比较，Met组体重明显下降(P<0.01)；与PCL组相比较，PCL+Met组体重减轻较为明显(P<0.01)。上述结果表明，Met组在手术后7周都可减轻小鼠体重，对PCL组也有同样的作用。

图1 各组小鼠手术后7周体重的变化(**P<0.01)

2.2 各组小鼠手术后7周高脂饲料消耗的变化

由于体重的变化可能与高脂饲料摄入量有关。因此，我们观察PCL手术后7周中，各组小鼠高脂饲料摄入的变化情况。如图2所示，与对照组相比较，Met组饮食下降(P<0.05)，与PCL组相比较，PCL+Met组饮食明显下降(P<0.01)。上述结果表明，Met可以抑制小鼠的食欲。而PCL手术后对小鼠食欲几乎没有影响。

图2 各组小鼠手术后7周高脂饲料的消耗情况(*P<0.05，**P<0.01)

2.3 各组小鼠血管中脂质含量的变化

为了评估二甲双胍对小鼠颈动脉血管中脂质斑块沉积的影响。我们分离小鼠LCA和RCA并进行冰冻切片，油红O染色，对其定量分析。形态结果如图3(封二)显示，对照组血管结构完整，血管弹力膜清晰可见，有少量脂质。Met组血管结构完整，血管弹力膜清晰可见，脂质区域不明显。PCL组血管中膜和内膜界限不明显，血管中脂质区域面积很大。PCL+Met组血管弹力膜清晰可见，中膜内膜界限模糊，血管中脂质区域面积较大如图3A；对LCA定量分析表明，与PCL组相比，给予二甲双胍后LCA中脂质面积显著降低(P<0.01)，如图3B。表明二甲双胍可以减少血管中脂质含量。

2.4 各组小鼠手术后7周肝脏形态学的变化

小鼠手术后继续高脂饮食饲养7周后，通过HE染色，结果如图4(封二)所示。与对照组相比较，Met组肝脏脂肪性、空泡样病变减轻。与PCL手术组比较，PCL+Met组肝脏空泡样病变有所缓解。如表2所示，与对照组相比，Met组小鼠肝脏脂肪变程度减轻(P<0.05)，与PCL组相比，PCL+Met组小鼠肝脏脂肪变程度减轻(P<0.05)。上述结果表明，二甲双胍能减轻高脂饲料引起的肝脏脂肪样病变，也减轻高脂饲料和PCL手术引起的肝脏脂肪样病变。

表2 四组小鼠脂肪病变程度分级

3 讨 论

NAFLD是指除酒精和其他明确的损肝因素外，肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征。在各种危险因素导致的NAFLD患者中，脂质的代谢紊乱和异常积累是最常见和最重要的病理学改变。在动脉粥样硬化的患者中，通常都伴随着高脂血症、脂质代谢异常的发生。文献报道ApoE基因敲除小鼠是研究高脂、高糖及动脉粥样硬化的理想模型，也有研究表明ApoE基因敲除小鼠给予高脂饮食，伴随着身体质量的脂肪增加以及腹部脂肪的增加，呈现出较为明显的“啤酒肚”[5]。颈总动脉部分结扎手术形成的颈动脉斑块可以加速动脉粥样硬化模型的形成，也可作为动脉粥样硬化亚临床表现的一个方式[7]。

二甲双胍对NAFLD有改善作用，在临床中二甲双胍经常与其他药物辅助治疗脂肪肝，以增加其疗效。ApoE基因敲除小鼠由于ApoE基因的敲除，导致其他脂类代谢物质在体内和进入肝脏沉积，从而直接导致NAFLD的形成[8]。

二甲双胍可以通过调节下丘脑中GDF15的表达水平，从而调节中枢神经系统的厌食反应，达到控制食物的摄取目的。Gontier等[9]研究发现，二甲双胍可以调节肠道菌群的代谢，影响肠道对葡萄糖的吸收，减少机体的能量摄入。二甲双胍可以通过改变NAFLD小鼠肝脏编码转录组和非编码RNA，从而阻碍非酒精性脂肪肝的发生[10]。Handzlik等[11]通过对非酒精性脂肪肝患者的研究发现，二甲双胍能有效减轻肝脂肪变性和肝纤维化。本实验也在整体水平上证明了二甲双胍减少动物对食物的摄取，小鼠肝组织HE染色结果显示肝细胞脂肪变性以及炎症细胞浸润显著减少。

综上所述，二甲双胍对ApoE基因敲除小鼠颈动脉及肝脏内脂肪沉积具有潜在的保护作用。虽然目前的研究未能明确二甲双胍是如何减少肝细胞脂肪变性和炎症细胞浸润，但表明二甲双胍可能是治疗颈动脉粥样硬化合并NAFLD的一个潜在的药物，这为颈动脉粥样硬化患者NAFLD病变提供了一种新的治疗策略。