外源钙离子对NaCl胁迫下油茶花粉萌发的影响

卢梦琪，周俊琴，刘懿瑶，杨 进，谭晓风

（中南林业科技大学 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410004）

我国盐渍化土壤面积达250 万hm2，主要分布在东北、华北、西北及华东地区的19 个省区，且面积有扩大趋势[1]。盐土中主要以NaCl、Na2SO4等可溶性盐类为主，土壤肥力差，结构透气性差，土壤中过量的盐离子可直接对植物造成毒害作用，对作物的生长产生胁迫，严重影响了农业生产。盐胁迫主要通过渗透胁迫、离子毒害和氧化胁迫等方式对植物造成伤害，影响植物的生长。渗透胁迫会降低土壤中的渗透压，从而使植物难以吸收水分，发生生理干旱，阻碍植物生长发育。离子胁迫会使盐离子在植株体内累积，破坏其正常生理代谢，从而抑制生长[2]。因此，改良和利用盐渍化土壤，恢复和提高其生产力是一项艰巨的任务。而关于盐胁迫对植物生长的影响已研究得很广泛和深入。例如，盐胁迫抑制文冠果幼苗的苗高生长量、地径生长量、地上生物量和地下生物量的增长，且随着NaCl 浓度的提高，抑制效果越明显[3]。低浓度的NaCl对具有一定耐盐性的‘吉美’海棠的生长不造成明显影响，而高浓度的NaCl 会对其生长和生理活动造成胁迫作用，且胁迫程度随胁迫时间的延长而增加[4]。外源喷施MT 或者Ca2+可显著降低甜瓜根系和叶片中的Na+和Cl-含量，增强其对盐胁迫的适应性[5]。在百合、紫荆、含笑和水稻等物种中，NaCl 对它们的花粉萌发和花粉管生长均有抑制作用，而Ca2+能够缓解NaCl对百合和水稻花粉萌发的抑制作用[6-9]，这间接说明了Ca2+参与了植物对盐胁迫等非生物胁迫的适应过程[10]。

油茶Camellia oleiferaAbel.是山茶属Camellia的常绿灌木或小乔木，耐贫瘠，抗性较强，主要在我国南方地区种植，是世界四大木本油料树种之一[11]。油茶种子榨出的油被称为茶油，是一种营养价值极高的可食用油，耐储藏，极易被人体吸收，且富含油酸、亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸以及角鲨烯、茶多酚和生育酚等多种活性物质[12-13]。2016年，油茶被正式列入全国大宗油料作物范畴，受到政府高度重视。发展油茶产业不仅有利于带动地方经济，助推精准扶贫，而且能提高食用植物油的供给，对维护国家油粮安全有十分重要的作用。目前，油茶的种植范围逐渐向北扩大，现已在湖北省、安徽省以及我国油茶北部边缘产区河南省大力发展。为了更科学合理地扩大油茶栽培面积，选育出适应各种逆境胁迫环境的油茶品种，提高油茶产量和经济价值，我国科研工作者已开展了油茶抗寒性[14]、耐旱性[15]、耐低温、耐高温[16]等方面的研究，但未见盐胁迫对其生长尤其是花粉萌发的影响等方面的报道。鉴于此，本研究以油茶‘华硕’花粉为材料，探究了不同浓度NaCl 对油茶花粉生活力、花粉萌发和花粉管生长的影响，以及Ca2+在NaCl 胁迫中所起到的作用，旨在探索给盐渍化地区引种油茶的可能性，进而指导生产实践，为油茶的引种和栽培提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 花粉的采集和处理

2019年11月，在晴天上午11:00，采集国家审定的油茶主栽品种‘华硕’盛花期露白的花苞，油茶实验基地位于湖南长沙望城县。将花苞带回实验室，用镊子将花药用轻轻捋下，摊开于室温下干燥，使花药充分开裂，散出花粉，用1.5 mL无菌离心管分装并存于-80℃冰箱。

1.2 实验设计

1.2.1 NaCl 浓度梯度与Ca2+浓度梯度设计

参考王湘南等[17]的方法，配制油茶花粉基本培养基：10%蔗糖+0.015%硼酸（pH=6.5～7.0），将此设为对照组（CK）。在基本培养基和花粉处理液（无菌水）中分别添加不同量的1 M NaCl母液，使其终浓度为0、1、5、10、20、30、50、80、100 和200 mM。两种培养基分别用于花粉的萌发和花粉活力检测。

通过不同浓度NaCl 对油茶花粉萌发影响的实验，确定对花粉有明显抑制作用时的NaCl 浓度。以此NaCl 浓度为基础，同时在基本培养基和花粉处理液（无菌水）中添加不同量的1 M Ca2+母液，使Ca2+终浓度为0、1、2、3、6、12、20 和25 mM，用于花粉的萌发和花粉生活力的检测，来研究Ca2+在NaCl 胁迫条件下对油茶花粉萌发和花粉管生长的影响。

1.2.2 花粉萌发实验

将花粉从-80℃冰箱取出，室温解冻2 h。在用毛笔蘸取花粉，均匀撒在相应培养基中，在25℃恒温摇床中轻轻晃动培养4 h。在显微镜下观察花粉萌发情况和花粉管形态，统计花粉萌发率和花粉管长度。每个处理重复3 次，每个重复观察5 个视野，每个视野中的花粉不少于50 粒。以花粉管长度大于花粉直径作为萌发的标准，统计萌发率。每一个重复随机测定至少50 个花粉管长度，统计花粉管长度平均数。

1.2.3 花粉生活力检测

花粉生活力采用噻唑蓝（MTT）染色法检测。参考Rodriguez-Riano 和Dafni[18]的方法，配制染色液：1% MTT+5%蔗糖，4℃避光保存。取200 μL花粉处理液于1.5 mL 无菌离心管中，用牙签蘸取解冻后的花粉，放入其中。滴加2～3 滴MTT 染料，37℃避光孵育30 min。混匀后，取50 μL 于凹面载玻片上进行显微观察，统计有生活力花粉所占的比例。每个处理重复3 次，每个重复观察3个视野。所用花粉与萌发实验所用花粉为同一批。

1.2.4 数据处理

所有统计数据用Excel 软件汇总，使用SPSS 25.0 软件进行单因素方差分析（邓肯分析），使用Origin 2017 软件制图。

2 结果与分析

2.1 NaCl 对油茶花粉活力的影响

通过MTT 染色法检测不同浓度NaCl 处理的油茶花粉生活力，结果表明，经1% MTT 染色后，各浓度NaCl 处理的花粉颜色均出现了明显变化，生活力高的花粉呈深蓝紫色、生活力较低的花粉呈浅红色或浅紫色、无生活力的花粉呈黄色或未着色，区分比较明显，容易分辨（图1B）。花粉生活力的统计结果表明：NaCl 浓度为0 mM（CK）时，花粉生活力为72.48%，随着NaCl 浓度的提高，花粉生活力逐渐下降。在NaCl 浓度为20 mM时，花粉生活力显著下降，只有36.22%，是CK的49.97%（图1A），当NaCl 浓度达到200 mM 时，花粉生活力只有26.37%，是CK 的36.38%。

图1 NaCl 处理下的油茶花粉生活力Fig.1 The pollen viability of Camellia oleifera under NaCl treatment

2.2 NaCl 对油茶花粉萌发的影响

用不同浓度的NaCl 处理花粉，对其萌发率进行统计，在显著性水平为0.05 时，分析各处理组萌发率之间的差异，且用不同字母表示其差异性，具体结果如图2所示。当NaCl 浓度为0 mM（CK）时，花粉萌发率为74.01%（图2A—B），随着NaCl 浓度的增加，萌发率逐渐下降。当NaCl 浓度达到80 mM 以上时，花粉萌发率低于10%，200 mM NaCl 处理下，花粉萌发率为0。说明NaCl 对油茶花粉的萌发有抑制作用，且抑制效果随着NaCl 浓度的提高而增强，而高浓度NaCl 可完全抑制花粉萌发。当NaCl 浓度为20 mM 时，花粉萌发率显著降低，为42.84%，是CK 的57.33%（图2A、C），所以，将用20 mM NaCl 对花粉萌发和花粉管生长进行胁迫，研究外源钙离子在其中的作用。

图2 NaCl 处理下的油茶花粉萌发率Fig.2 The pollen germination rate of Camellia oleifera under NaCl treatment

观察花粉管的形态时发现，在NaCl 胁迫处理下，部分花粉管表现出了顶端膨大的形态，影响了花粉管的生长（图3B）。对花粉管长度进行统计和显著性水平为0.05 的差异性分析，发现随着NaCl 浓度的提高，花粉管长度逐渐变短。当NaCl 浓度为0 mM（CK）时，花粉管长度为32.29 μm，当NaCl 浓度提高到1 mM 时，花粉管长度减短到25.74 μm，出现了明显的抑制作用。当NaCl 浓度提高到20 和30 mM 时，花粉管长度分别减短到23.75 μm 和17.36 μm，分别是CK 的73.54%和53.75%。当NaCl 浓度大于80 μm 时，花粉管长度小于6 μm（图3A、C），说明NaCl抑制油茶花粉管的伸长，且高浓度NaCl 可完全抑制花粉管的生长。

图3 NaCl 处理下的花粉管生长情况Fig.3 The pollen tube growth of Camellia oleifera under NaCl treatment

2.3 Ca2+在NaCl 抑制油茶花粉生活力中的作用

在20 mM NaCl 的胁迫下，不同浓度的外源Ca2+处理油茶花粉，经1% MTT 染色，统计分析后发现，随着Ca2+浓度的提高，花粉生活力呈缓慢下降趋势。当Ca2+浓度为0 mM 时，花粉生活力为45%。当Ca2+浓度为1 mM 时，花粉生活力明显下降，为36.98%，是0 mM Ca2+处理的82.18%。当Ca2+浓度高于3mM 时，生活力一直维持在28.59%左右，是0 mM Ca2+处理的63.53%（图4）。说明在20 mM NaCl 的胁迫下，外源Ca2+对油茶花粉生活力有一定的抑制作用，当Ca2+浓度高于3 mM 时，抑制效果最为明显。

图4 Ca2+对NaCl 胁迫下的油茶花粉生活力的影响Fig.4 The effects of Ca2+ on the pollen vitality of Camellia oleifera under NaCl stress

2.4 Ca2+在NaCl 抑制油茶花粉萌发中的作用

在20 mM NaCl 的胁迫下，研究不同浓度外源Ca2+对油茶花粉萌发和花粉管生长的影响。统计和分析花粉萌发率发现，在Ca2+浓度为1 mM 时，花粉萌发率稍有下降，为41.94%，但与0 mM Ca2+处理下无明显差别。而当Ca2+浓度提高到2 mM 时，花粉萌发率显著提高，为60.5%，是0 mM Ca2+处理下的130.92%，之后花粉萌发受到抑制，萌发率下降且维持在29%左右（图5A）。对花粉管长度进行测量和分析发现，随着Ca2+浓度的增加，花粉管长度缓慢增长。当Ca2+浓度为1 mM 时，花粉管长度为23.06 μm，与0 mM Ca2+处理无明显差别，当Ca2+浓度提高到2 mM 时，花粉管长度有明显提高，为28.4 μm。当Ca2+浓度在3～20 mM 时，花粉管的长度稍有增长，但与2 mM 时的无明显差异。而当Ca2+浓度提高到25 mM 时，花粉管是最长的，为35.05 μm，明显高于CK 和0 mM Ca2+处理（图5A—B）。

观察花粉管形态发现，花粉管顶端有异常现象。当Ca2+浓度为1～2 mM 时，有少量花粉管存在顶端破裂现象，但这种现象主要出现在花粉管刚刚长出来时，此时花粉管长度短于花粉直径，并未达到萌发判断标准。当Ca2+浓度为3～25 mM时，花粉管顶端破裂现象更加严重，在不同长度的花粉管中均存在，但主要存在于刚刚萌发出来的花粉管或者较短的花粉管中（图5C）。

图5 Ca2+对NaCl 胁迫下的油茶花粉萌发和花粉管生长的影响Fig.5 The effects of Ca2+ on the pollen germination and pollen tube growth of Camellia oleifera under NaCl stress

由此可知，在20 mM NaCl 胁迫下，2 mM Ca2+能缓解这种胁迫效应，促进油茶花粉萌发和花粉管伸长。浓度高于2 mM 的Ca2+对油茶花粉管伸长也有明显促进作用，但高浓度Ca2+（≥3 mM）能使部分油茶花粉管顶端破裂。

3 结论与讨论

植物的花粉活性、花粉萌发和花粉管生长直接关系到植物生殖生长中的授粉受精环节，影响种子的形成和产量。本试验是通过MTT 染色法来判断油茶花粉生活力的，其原理是MTT 被线粒体内膜上的琥珀酸脱氢酶还原，形成一种非水溶性蓝紫色结晶甲臜，沉积在细胞中[19]。银腺杨有活性的花粉被MTT 染成红色[20]，香蕉有活性的花粉被MTT 染成紫色[21]。在本研究中，油茶有活性的花粉被MTT 染成深蓝紫色、浅红色或者浅紫色，说明不同植物花粉的MTT 染色效果不一样。NaCl 对油茶花粉生活力有抑制作用，在NaCl 浓度在0～20 mM 时，花粉生活力与花粉萌发率比较接近，而当NaCl 浓度高于20 mM 时，花粉生活力高于萌发率，说明当NaCl 浓度高于20 mM 时，部分有萌发潜力的花粉受到了更明显地抑制而没有萌发。外源Ca2+不能提高反而抑制了NaCl 胁迫条件下的花粉生活力，这可能是NaCl 对花粉生活力的抑制作用是不可逆的，并且外源Ca2+可能对花粉产生了毒害作用。另外，在NaCl 胁迫条件下，除了2 mM Ca2+处理下的花粉生活力低于萌发率之外，其他Ca2+浓度下的花粉生活力与萌发率相差不大。以上可说明油茶与香蕉[21]、杜鹃红山茶[22]等植物一样，也适合用MTT 染色法判断花粉生活力。

在本研究中，油茶花粉和花粉管对NaCl 比较敏感，低浓度的NaCl 显著抑制花粉萌发和花粉管的生长，且抑制效果随NaCl 浓度的提高而增强，这与紫荆[7]、含笑[8]等树种一致，但栀子[23]、毛杜鹃[24]等树种的花粉对NaCl 的响应不一样，呈现出“低浓度促进、高浓度抑制”的规律，说明不同树种的花粉对NaCl 的敏感性不一样。而一定浓度的外源Ca2+可以缓解NaCl 对油茶花粉的胁迫作用，促进NaCl 胁迫条件下花粉萌发和花粉管生长，与百合[6]、水稻[9]等树种一致，这说明Ca2+可能参与了油茶花粉对NaCl 环境的适应过程，也暗示着NaCl 对油茶花粉的抑制作用可能主要是一种离子毒害。在NaCl 胁迫条件下，通过质膜运输的Ca2+能被Na+取代，导致质膜的通透性和选择透过性发生改变，从而阻碍正常的生理生化代谢过程[25]，而外源添加Ca2+后，可能补充了植物对Ca2+的一部分需求，从而起到了缓解抑制的效果。

花粉的萌发和花粉管的生长都离不开Ca2+。水稻成熟花粉中钙颗粒主要沉积在花粉外壁，而胞内基本无钙颗粒沉积，花柱的乳突细胞表面和薄壁细胞中也存在钙颗粒[26-27]。花粉水合后，大量的钙颗粒聚集到萌发孔启动花粉的萌发，花柱道里会形成Ca2+梯度，引导花粉的定向生长[28-29]。盐胁迫会破坏细胞内离子稳态，Na+、Cl-大量内流，K+、Ca2+等离子含量发生变化[30]。因此，可以猜测当花粉培养液中存在大量的Na+、Cl-时，Na+、Cl-会内流进入花粉和花粉管细胞，打破原有的离子平衡状态，影响花粉和花粉管胞内的Ca2+分布，造成Ca2+无法正常形式其功能，最终导致花粉萌发和花粉管生长受阻。在外源添加Ca2+后，调节了离子平衡，促进花粉萌发和花粉管生长，但Ca2+只有在合适浓度范围内才有促进作用。在本研究中，2 mM Ca2+显著促进NaCl 胁迫条件下花粉的萌发，可能是适量的Ca2+聚集到了萌发孔，促进了花粉萌发，而高浓度（≥3 mM）的Ca2+会使刚萌发出的花粉管顶端破裂，对花粉萌发有抑制作用，可能是高浓度的Ca2+造成了细胞Ca2+中毒或者细胞膨压过大。这与百合[5]等结果一致。然而，NaCl 在油茶花粉和花粉管内如何起胁迫作用的，Ca2+是如何提高油茶花粉和花粉管对NaCl的适应能力的，还需进一步研究。

综上所述，NaCl 会对油茶花粉生活力、花粉萌发和花粉管生长造成胁迫，且胁迫程度随着NaCl 浓度的提高而增加。因此，在油茶的栽培和管理过程中，应对油茶进行合理的盐分管理措施，应避免在连续干旱时不浇水而使土壤积盐以及将油茶引种到盐渍化地区，使油茶处在NaCl 胁迫环境中。一定浓度的Ca2+能有效促进NaCl 胁迫下油茶花粉的萌发和花粉管的伸长，可为今后研究提高油茶的耐盐性提供参考资料。