4种α-芋螺毒素来源多肽合成及功能鉴定

吴 赟，曹 锟，张广献 （.广东医科大学广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 53808；.广州中医药大学基础医学院，广东广州 50006）

芋螺毒素是海洋软体动物芋螺的毒管组织分泌的由10～50个氨基酸残基组成的小肽[1]。芋螺毒素通过选择性靶向不同类型的神经递质受体或电压门控离子通道，通常被用作神经科学研究和药物开发的分子工具[2‑3]。根据芋螺毒素保守的信号肽序列，可以将数目繁多的芋螺毒素分成29 个超家族[4]。其中A‑超家族芋螺毒素又可根据药理学作用靶点进一步分为α‑、κA‑、αA‑家族。α‑家族芋螺毒素具有典型的CC‑C‑C半胱氨酸框架，通常由12～19个氨基酸残基组成，主要作用靶点为烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)[5]。烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)分为肌肉型和神经型两种，其中肌肉型nAChR 普遍存在于脊椎动物骨骼肌细胞以及某些鱼的放电器官细胞的质膜上。受体与乙酰胆碱结合，引起Na+通道的开放，Na+流入靶细胞，使得质膜去极化并引起细胞的收缩。α‑芋螺毒素能与神经肌肉接头处突触后膜上nAChR的α亚基结合，从而竞争性地抑制乙酰胆碱与受体结合，阻断神经‑肌肉兴奋信号的传递[6]。目前在具有抗皱功能的化妆品中广泛应用的蛇毒SYN‑AKE 是1 种来源蛇毒的三肽[7]，它主要作用于肌肉型nAChR 的突触后膜，从而抑制神经肌肉收缩。本研究从α‑芋螺毒素中筛选并合成了4 种多肽，探讨这些多肽对肌肉收缩的抑制作用及其应用前景，旨在为开发新型抗皮肤皱纹产品提供参考。

1 材料和方法

1.1 多肽合成

合成的多肽序列见表1。采用Fmoc 法[8]，通过全自动多肽合成仪（海南建邦制药科技有限公司，型号JB2014001）进行多肽的合成。从仪器上裂解下来的多肽，用乙醚沉淀后，在1 500×g下离心10 min。收集沉淀，进行冷冻干燥。取少量冻干后的粗肽溶解，经10 000×g 离心2 min 去除杂质后，上C18 反相柱进行高效液相色谱（HPLC）检测及纯化。线性梯度洗脱，215 nm 和280 nm 处双波长检测。将HPLC 收集的目标峰取1 μL，进行质谱检测分析。确定多肽分子量正确后，用于后续实验。根据质谱结果，收集HPLC 纯化后的目的峰，再次冻干。再经HPLC 纯化，经检测达到95%以上纯度后，第3 次冻干成粉末，−20 ℃保存备用。

表1 所合成的4个多肽序列

1.2 肌细胞收缩检测

使用Cell Biolabs 公司的细胞收缩检测试剂盒（Collagen‑based Contraction Assay Kit,CBA‑201）评估肌肉细胞的收缩性。将人骨骼肌细胞（HSMC，美国ATCC）在骨骼肌细胞培养基（skeletal muscle cell medium,SkMCM，ScienCell 公司，3501‑b）中，37 ℃，5% CO2条件下培养。将采集的细胞进行重悬，使细胞终浓度为（2～5）×106个细胞/mL 培养基。将2倍体积的细胞悬液和8 倍体积的预冷的胶原凝胶溶液混合制成胶原晶格。在24 孔板的每个孔中加入0.5 mL的细胞‑胶原混合液，在37 ℃孵育1 h。当胶原聚合后，向凝胶晶格中添加1.0 mL 培养基。培养48 h，期间观察胶原的收缩变化。在释放收缩基质之前，用浓度为100 μmol/L 的多肽溶液处理细胞1 h。24 h 后用直尺测量胶原凝胶大小的变化。使用细胞培养基作为阴性对照，蛇毒三肽SYN‑AKE 作为阳性对照。收缩率（mm）=释放前胶原凝胶的直径−释放24 h 后胶原凝胶的直径。

1.3 骨骼肌收缩检测

实验所用SD大鼠购买自广州中医药大学实验动物中心[许可证号SYXK（粤）2018‑0182]。30 只大鼠（150～200 g）分为6 组，每组5 只。1 组为阴性对照组，用台氏液代替多肽处理组织；1 组为阳性对照组（SYN‑AKE）；剩余4 组分别检测不同的样品多肽。大鼠腹腔注射1 mL 10%的水合氯醛进行麻醉后，剃去大鼠后肢及躯干后背部的毛，剪开皮肤，小心剥离，暴露肌层。分离腓肠肌内外侧头至踝关节，游离腓肠肌内侧头肌腱，并用手术线结扎，剪断。于腓肠肌根部肌腱处结线接张力换能器，坐骨神经置于刺激电极上，接入BL‑420E生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）。以连续单刺激的方式给予坐骨神经电刺激，刺激参数为：延时l00 ms，波宽0.5 ms，频率0.5 Hz，强度5 V，扫描速度为4.00 s/div，待模型稳定后，记录腓肠肌收缩的张力大小作为多肽作用前的对照。用无菌脱脂棉给药，待测药品工作浓度为100 μmol/L。每隔5 min 给予坐骨神经电刺激，记录腓肠肌收缩曲线，至腓肠肌收缩作用至25 min。

1.4 细胞毒性检测

使用96孔板培养和MTT染色法检测多肽对人骨骼肌细胞的细胞毒性[9]。人骨骼肌细胞在骨骼肌细胞培养基中，37 ℃，5% CO2条件下培养。将细胞以约105个/mL 接种于96 孔板，每孔接种90 μL，置CO2培养箱中培养至对数生长期。按预设的浓度梯度分别加入10 μL 的多肽，使每孔中的多肽终浓度为1、2、5、10、20、50、100 μmol/L，每1 个梯度设置3 个重复。空白组加入100 μL 骨骼肌细胞培养基。继续培养48 h后，每孔加入20 μL 的MTT（5 g/L），然后置于37 ℃温育4 h。小心除去上清后，每孔加入100 μL DMSO，振荡约10 min 溶解沉淀，随后用酶标仪检测OD 值，波长490 nm。

1.5 皮肤刺激性/腐蚀性检测

根据《化妆品安全技术规范》2015 年版中毒理学试验方法中的皮肤刺激性/腐蚀性试验方法检测多肽对家兔皮肤的刺激性/腐蚀性。新西兰白色家兔4 只（质量合格证号：44007600002312），身体质量2.3～2.4 kg，购自广州花都区花东信华实验动物养殖场[许可证号为SCXK（粤）2019‑0023]。试验前24 h，将家兔背部脊柱两侧被毛剪掉，剪毛中不损伤皮肤表面，去毛范围为3 cm×3 cm，涂抹面积为2.5 cm×2.5 cm。取0.5 mL 浓度为1 mmol/L 的多肽溶液涂抹在一侧皮肤上，另一侧涂0.5 mL 纯化水作为对照，每天涂抹一次，连续涂抹14 d。涂抹1 h 后观察结果，按《化妆品安全技术规范》2015 年版的皮肤刺激性/腐蚀性试验表1标准进行评分。

1.6 统计学处理

各实验组数据分别与对照组比较，采用t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。各图中的所有误差线表示至少3次重复计算的平均值的标准误差。

2 结果

2.1 多肽的合成与纯化

所合成的4 个多肽（芋螺毒素SI[10]、Reg1d[11]和多肽片段SDPR、ELDGNG[12]）均选自A超家族芋螺毒素（序列见表1）。采用全自动合成了上述多肽，并用RP‑HPLC 对其进行了纯化，通过质谱鉴定了多肽的分子量（图1）。

图1 经HPLC纯化后的4个多肽的质谱鉴定结果

2.2 多肽对肌细胞收缩的抑制作用

通过比较胶原凝胶在多肽处理前后的直径变化，发现多肽Reg1d、SDPR 和ELDGNG 对人骨骼肌细胞的收缩有一定的抑制作用。而多肽SI 对骨骼肌细胞的收缩没有明显抑制作用（图2）。以上结果均至少重复3次。

图2 4个多肽对肌细胞收缩的抑制作用

2.3 多肽对骨骼肌收缩的抑制作用

使用芋螺毒素Reg1d 处理腓肠肌后，对肌肉收缩的抑制作用明显，25 min 时的抑制作用与阳性对照SYN‑AKE 的抑制作用相当；芋螺毒素SI 对骨骼肌收缩只有微量的抑制作用；而多肽SDPR和ELDGNG则对腓肠肌的收缩没有明显作用（图3）。

图3 4个多肽对不同时间点的大鼠骨骼肌收缩的抑制作用

2.4 芋螺毒素Reg1d的细胞安全性检测

根据以上肌细胞收缩和骨骼肌收缩实验的结果，选择了芋螺毒素Reg1d 进行接下来的细胞安全性和皮肤安全性检测。实验结果显示，在7 个检测浓度下，Reg1d 对骨骼肌细胞的存活均没有明显毒性作用（图4）。

图4 芋螺毒素Reg1d对人骨骼肌细胞存活率的影响

2.5 芋螺毒素Reg1d的皮肤安全性检测

根据《化妆品安全技术规范》2015 年版中的皮肤刺激性/腐蚀性试验方法检测芋螺毒素Reg1d 对家兔皮肤的刺激性/腐蚀性。在试验观察期内家兔均没有出现红斑和水肿；每天每只动物平均积分为0，未见其他毒性反应特征，表明1 mmol/L的Reg1d对皮肤多次给药，无刺激性。结果见表2。

表2 芋螺毒素Reg1d对家兔多次皮肤刺激性试验结果

3 讨论

芋螺毒素对不同的离子通道、G 蛋白偶联受体和神经递质转运体具有高度的特异性和亲和力[13]。目前已经有一些芋螺毒素正在处于临床试验阶段，其中的μ‑芋螺毒素MVIIA，已被美国FDA 批准用于治疗难以控制的严重慢性疼痛[14]。α‑芋螺毒素是nAChRs抑制剂，其在芋螺物种中的丰富表达，为寻找nAChRs的靶向药物，提供了一个具有可变初级序列、结构、药理特性和作用方式的天然多肽库[15]。某些α‑芋螺毒素的高亚型选择性是鉴定天然nAChR 亚型参与神经递质释放调控的关键[16]。α‑芋螺毒素的结构/功能特性也促进了具有更高效价和/或亚型选择性的毒素多肽类似物的开发。在本研究中，主要考察4 个来源于α‑芋螺毒素的多肽对于肌肉收缩的抑制作用，其中芋螺毒素Reg1d 对肌细胞和骨骼肌的收缩表现出了明显的抑制作用，同时也具有的良好的安全性。

为减小芋螺毒素的分子量，使其更适合于药物应用，此前已经文献报道了一些方法，例如将芋螺毒素MII 或MrIA 的N 到C 端环化以及用二硒环化键取代二硫键[17‑18]，用化学柔性间隔物替换芋螺毒素SIIIA序列中的部分氨基酸等[19]。然而，这些方法并不能完全去除芋螺毒素中的二硫键。芋螺毒素的分子量仍然较大。在本研究中，我们从α‑芋螺毒素中选择并设计了4 个多肽。其中包括2 个全长的芋螺毒素SI 和Reg1d，以及2 个来自于芋螺毒素的多肽片段SDPR和ELDGNG。我们期望通过相关的功能实验，了解多肽片段是否具有与完整毒素类似的活性。然而实验结果显示，2 个多肽片段并未表现出优于或接近完整毒素的活性，这可能与多肽片段的选择有关。在芋螺毒素的氨基酸序列中，除了保持基本空间结构的半胱氨酸外，剩余的氨基酸中有些与毒素的功能密切相关，有些与毒素的特异性相关，还有一些与毒素的结构稳定相关。在接下来的研究中，我们将从更多的芋螺毒素中选择更多的多肽片段来进行功能检测。

本研究选择了来源于蛇毒的三肽化合物SYN‑AKE 作为阳性对照。SYN‑AKE 是一种基于合成蛋白质片段的化学物质，该片段源自庙蝰蛇蛇毒中的Waglerin‑1 肽，可以减少肌肉细胞的收缩。因此，SYN‑AKE 被广泛地应用到了抗皱类的化妆品中[20]。与SYN‑AKE 相比，芋螺毒素Reg1d 表现出了相似的生物活性。虽然Reg1d 的分子量较大，但是它具有良好的生物安全性。在后续试验中，可以通过特定氨基酸的去除和替换，进一步降低Reg1d的分子量，Reg1d依然有望开发成为一种新的原料，应用于抗皱纹类化妆品中。