基于CRISPR/Cas9 的新冠病毒双基因检测试纸条

沈海聪， 朱 志

（厦门大学化学化工学院，福建厦门361005）

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 （SARSCoV-2） 给全人类生命健康和公共医疗系统带来了严重威胁。 迄今为止，由于缺乏针对该病毒的有效药物和疫苗，快速、大规模的感染者鉴定对病毒的扩散控制有着重要意义。 SARS-CoV-2 的检测方法主要分为3 类： 胸部计算机断层扫描（CT），血清学检查和核酸检查。胸部CT 能够检测到患者的肺部病变，但它不能准确识别轻度肺部病变或无症状的患者，特异性不够。 血清学检测主要检测患者血清中的抗体，但受限于检测窗口期。 相比之下，即便在感染的初期，患者鼻咽拭子中的病毒滴度也比较高， 因此直接对病毒进行RNA 检测是比较推荐的[1]。 反转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）被认为是SARS-CoV-2 核酸检测的金标准。 然而，RT-qPCR 方法需要专用且昂贵的设备， 专业的操作以及较长的样品检测时间，不利于资源匮乏地区、学校、诊所和家庭的使用。 作为RT-qPCR 方法的有效补充，基于核酸恒温扩增的技术和CRISPR 技术的侧向层析试纸条可满足快速检测的需求[2]。 当前的研究大都只是针对单一的靶基因，这对临床的诊断是不够准确的。 最近，华南师范大学生命科学学院周小明教授课题组联合湖北省疾病预防控制中心，将Cas9/sgRNA 系统整合到已建立的生物传感平台中，通过胶体金试纸条对新冠病毒的E 和Orf1ab基因片段进行联合检测，以期获得更加可靠的检测结果[3]， 这一研究成果近期发表在Angew．Chem．Int．Ed．杂志上。

为了实现双基因检测的目标，他们首先设计了包括两条测试线（T 1 和T 2）和一条质控线（C）的胶体金试纸条（图a）。 随后，利用多重RT-RPA恒温核酸扩增技术，对目标基因E 和Orf1ab 进行扩增使其DNA 双链产物分别带上生物素和地高辛标记物（图b）。 同时利用基因特异性的Cas9/sgRNA1 和Cas9/sgRNA2 复合物对相应的DNA双链产物进行识别和结合。 在试纸条分析中，将以上复合物加到试纸条样品垫上，液体流经金标垫时， 预固定的AuNP-DNA 探针通过核酸杂交与Cas9/sgRNA 上的环形支架序列结合， 使得DNA 双链产物间接带上纳米金信号；接着，复合物依次流过T1（固定有链霉亲和素）和T2（固定有抗地高辛抗体）， 带有生物素或地高辛标记物的复合物分别被捕获； 多余的AuNP-DNA 探针则被C 线捕获。 最后，通过肉眼识别即可得到相应的检测结果（图c）。 这种新开发的双靶标核酸检测试纸条可提供4 个潜在的测试结果：①仅C线可见，表示测试结果为阴性；②③T1 线和C 线（或T2 线和C 线）可见，表示只有单个基因被发现，暗示有可疑感染；④T1 线、T2 线和C 线均可见， 确认SARS-CoV-2 感染。 在单个反应中（25 μL），该技术可检测出100 个RNA 拷贝。 在临床64 例样本的检测中， 该方法具有100%的阴性预测值和97．14%的阳性预测值。 综上，该平台具有为资源贫乏地区提供更加准确便捷的SARSCoV-2 或其他传染病诊断的潜力。