水氮耦合对设施土壤N2O和NO排放的影响

吕金东，张丽媛，虞娜，邹洪涛，张玉玲，张玉龙

（沈阳农业大学土地与环境学院，农业部东北耕地保育重点实验室，发改委土肥资源高效利用国家工程实验室，沈阳110866）

作为大气中活跃的痕量气体，N2O是《京都议定书》规定的长生命周期温室气体之一，其百年增温潜势约为CO2的298倍[1]，NO被IPCC认定为间接温室气体[2]，因此二者对气候和环境变化具有重要影响。农田土壤是N2O和NO的重要排放来源，而设施土壤排放量远高于粮田土壤，其排放特征不容忽视[3-4]。

农田水分管理和施氮量是影响N2O和NO排放的重要因素[5]。微生物主导的土壤氮循环过程极易受水分和施氮量的影响而发生改变，尤其设施土壤特殊的水热条件以及过量的水氮投入下，经常导致土壤N2O和NO同时产生[6]。在设施土壤滴灌模式下，土壤长期处于厌氧或干湿频繁交替状态均会加快硝化反硝化速率，显著增加N2O和NO排放[7]。土壤硝化和反硝化以及硝酸盐异化还原成铵等过程都会产生N2O和NO排放[8]，如图1所示。集约化菜地由于长期施用氮肥且随施氮量增加，无机氮含量升高，产生N2O和NO排放[9-11]。研究表明，增加灌水或施氮量超过150 kg·hm-2时，在提高温室蔬菜产量的同时也增加了N2O和NO排放量[12]。合理的设施滴灌施肥且减氮1/3可在保证产量的前提下，显著降低33%温室N2O+NO年排放量[13-14]。前期试验结果表明，灌水下限（35 kPa）配合施氮量（75 kg·hm-2）可保证番茄产量的同时减少N2O排放[15]。

水分和氮素是影响设施蔬菜水氮高效利用最重要的调控因素，有效的灌溉施肥制度能够提高土壤供氮能力和减少氮素损失[16]。合理的水氮调控措施对设施土壤N2O和NO减排及蔬菜产量提高具有重要意义。目前关于设施水氮调控下，N2O和NO排放的同步观测研究较少，N2O和NO的消长特征尚不清楚。本研究基于连续7 a的设施水氮定位试验，研究水氮耦合对设施土壤N2O和NO排放特征的影响，旨在为制定设施土壤N2O和NO减排及水氮资源高效利用的管理措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验地点位于沈阳农业大学设施生产试验基地内（41°49′N，123°34′E），属于温带半湿润大陆性气候，供试土壤为棕壤，作物为番茄。设施水氮定位试验于2012年开始，每年4—8月以相同的试验方案开展田间试验，休耕期为每年9月到次年3月，以减少番茄连作障碍的影响及北方冷棚蔬菜越冬困难问题。2012年试验地布设前，0～20 cm土壤有机质含量10.9 g·kg-1，全氮含量1.4 g·kg-1，碱解氮含量57.8 mg·kg-1，速效磷含量25.2 mg·kg-1，速效钾含量90.2 mg·kg-1，土壤pH 7.1。

1.2 试验设计

试验采用灌水下限和施氮量两因素三水平随机区组设计，灌水下限土壤水吸力分别为25（W1）、35 kPa（W2）和45 kPa（W3），氮素水平分别为75（N1）、300 kg·hm-2（N2）和525 kg·hm-2（N3）（当地习惯施氮量为300 kg·hm-2）。组合共9个处理，重复4次。小区面积2.5 m2，行距平均55 cm，株距30 cm，留4穗打顶。试验小区在建设伊始，为防止水分、养分的运移，用埋深60 cm的塑料布对各小区进行防渗隔离处理。

各小区统一施用有机肥（膨化鸡粪26 400 kg·hm-2）和过磷酸钙（220 kg·hm-2，以P2O5计）作基肥，氮肥（尿素）和硫酸钾（300 kg·hm-2，以K2O计）在番茄定植前和果实膨大期等比例施入。番茄从移栽到收获历时101 d，2次追肥时间分别为定植后第48 d和第71 d。采用膜下滴灌进行灌溉，即在定植后先将滴灌带置于距番茄5 cm左右，然后进行地膜覆盖。各小区埋设张力计和TDR探头指示土壤水吸力和含水率变化，确定灌溉始点和灌溉量。番茄定植后相继浇灌定植和缓苗水后，进行水分处理。灌水下限土壤含水率由设计土壤水吸力值计算，即当20 cm土层张力计读数（早8：00—8：30）达到灌水下限土壤水吸力值时，依该观测值，使用土壤水分特征曲线计算土壤体积含水率，其方程为：

式中：h为土壤水吸力，kPa；θ为土壤体积含水率，cm3·cm-3。

各小区单次灌溉量计算公式：

式中：Q为单个小区一次灌水水量，m3；Qf和Ql分别为灌水上限和下限土壤含水率，m3·m-3；H为计划湿润层厚度，m，取H=0.3 m；R为土壤湿润比，取R=0.5；S为小区面积，m2。灌溉上限为田间持水量（0.348 9 cm3·cm-3）。定植采用一致的水分管理，14 d后按照试验设计进行灌溉处理，各水氮处理总灌水量（m3·hm-2）及平均灌溉周期（d）如表1所示。

1.3 指标测定及计算

1.3.1 N2O和NO排放通量

采用静态箱法，使用气泵进行待测气体的采集。试验前，静态箱底座边缘5 cm置于灌水湿润部位（无作物种植及地膜覆盖），底座和箱体体积分别为40 cm×40 cm×10 cm和40 cm×40 cm×40 cm。采气时箱体放置在底座上，外侧水封。气体样品采样时间为2019年番茄生长季，从定植第2 d开始，固定在上午8：00—11：00进行，平均每周采集一次，追肥后第2 d增加采样一次，直至番茄成熟收获后采集最后一次。每个处理随机选择3个固定位置，分别在密闭后0、10、30 min各采集一次，同时记录箱内温度，每次同时抽取40 mL和1 000 mL气体于不同气袋内，带回实验室分别用于N2O和NO的测定。

利用气相色谱仪-电子捕获检测器（Agilent 7890B-ECD，USA）和NO-NO2-NOx分析仪（Thermo Fisher 42i，USA）分别测定气体样品的N2O和NO浓度。气体排放通量的计算公式为：

式中：F为N2O或NO的排放通量（以N计），μg·m-2·h-1；ρ为标准状态下气体密度，NO-N为0.625 kg·m-3，N2O-N为1.25 kg·m-3；h为静态箱净高度，m；dc/dt为静态箱内气体浓度变化率，μL·L-1·min-1；T为采样过程中箱内平均空气温度，℃；k为时间转换系数，60 min·h-1。由于箱内气体压强恒定，可以忽略对N2O和NO的影响，在计算时未考虑压强。

1.3.2 单位产量N2O、NO排放量

单位产量N2O、NO排放量的计算公式为：

式中：Y-S(N2O,NO)为单位产量N2O、NO排放量（Yieldscaled N2O，NOintensity），g·kg-1；CF为气体累积排放量（以N计），kg·hm-2；Yyield为番茄产量，t·hm-2。

1.3.3 土壤无机氮的测定

土壤样品采样时间从定植第2 d开始收集，以后每次气体采集的同时（除第2次外），采用S形五点采样法采集箱内表层土壤样品，采样深度为0～10 cm，-20℃保存备用。

称取新鲜土样，水土比为5∶1，采用0.01 mol·L-1CaCl2浸提-AA3自动分析仪法测定铵态氮和硝态氮含量。

1.3.4 土壤氮循环功能基因丰度

在第一和第二次追肥后，采集各处理表层土壤样品，存于-80℃冰箱中，用于功能基因分析。采用Fast DNA®Spin Kit for Soil试剂盒（MPBio）提取土壤DNA，称取1.0 g土壤，按照试剂盒内说明书的方法操作提取样品DNA，各功能基因定量PCR过程在实时荧光Gene 9600定量PCR仪完成。定量PCR所用的反应体系均为15μL，包含7.5μL的SYBR®Premix EX TaqTM（Takara）、各0.05μL上下游引物、7.2μL灭菌双蒸水（ddH2O）和0.2μL DNA模板。定量PCR所用的扩增引物见表2。

表1水氮各处理总灌水量及平均灌溉周期Table 1 Total irrigation amount and average irrigation period of irrigation and nitrogen treatments

表2功能基因及PCR扩增引物Table 2 Functional genes and amplification primer of PCR

1.4 试验数据处理

采用Excel 2010进行数据整理和计算，DPS 7.05进行随机区组双因素方差分析及相关分析，多重比较采用Duncan法，方差分析各因子离差平方和占总离差平方和比例分析各因子的影响效应，Canoco 5.0进行冗余分析（RDA），Origin 9.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 水氮耦合对设施土壤N2O和NO排放的影响

图2为水氮耦合下土壤N2O和NO排放的动态变化。由图2可知，水氮耦合下的N2O排放通量变化规律基本一致（图2a～图2c），在番茄生长季内，各处理在基肥和两次追肥后出现排放峰，两次追肥后N2O排放峰值远小于基肥，其余观测时间呈较低水平。定植第48 d时，除W2N3、W3N2和W3N3处理，其他水氮处理在第一次追肥前峰值出现负峰，表现为N2O的吸收。生育期内，N2O通量均表现为强变异特征（CV＞1），尤以N1变异最大。相同灌水下限，同期的排放峰随施氮量增加而增加；而相同施氮量下，同期的排放峰随灌水下限变化各异。施氮量对NO累积排放的影响总体表现为N3＞N2＞N1。NO排放通量的变化与N2O相似，如图2d～图2f所示，水氮耦合下NO排放通量也表现在基肥和追肥后出现排放峰，基肥后峰值远大于追肥后，为追肥的3～11倍。此外，各水氮处理NO通量排放峰持续时间较长，在基肥施入后20 d内均有较高的排放峰。各水氮处理NO排放受施氮量影响更为明显，同一灌水下限，N3水平的NO排放通量普遍高于其余N水平。

2.2 水氮耦合对设施土壤铵态氮和硝态氮含量的影响

图3为水氮耦合下土壤铵态氮和硝态氮含量的动态变化。由图3a～图3c可知，各水氮处理铵态氮含量呈波动变化。不同时期铵态氮含量随施氮量的增加而增加，均表现为N3变化最大。相同灌水下限，定植后20 d内，W1水平各水氮处理铵态氮含量保持缓慢下降的趋势。W2和W3水平各水氮处理，除N1处理外，均表现为先升高后下降的趋势，并有峰值出现。尤其在追肥后铵态氮含量出现峰值，表现为先升高后降低的趋势。

由图3d～图3f可知，各水氮处理硝态氮含量呈波动变化，随灌水下限增加，硝态氮含量的变异有增大的趋势。各水氮处理的硝态氮含量在第一次追肥后均出现上升趋势，并在第二次追肥后出现最大峰值，直到番茄收获又出现峰值。整个生育期内，相同灌水下限，W2水平硝态氮含量变化规律表现为N3＞N2＞N1，W1和W3水平硝态氮含量变化规律不一致。

2.3 水氮耦合对设施土壤硝化和反硝化基因丰度的影响

表3为水氮耦合对两次追肥后土壤硝化和反硝化基因的影响。双因素方差分析结果表明，水分单一效应对第一次追肥后amoA-AOA、nirS和nosZⅠ基因影响达极显著水平（P＜0.01），对第二次追肥后的所有功能基因均达极显著差异（P＜0.01）。而施氮量单一效应对第一次追肥后的amoA-AOA和nirS达极显著差异（P＜0.01），nosZⅠ基因达显著差异（P＜0.05）。施氮量单一效应对第二次追肥后的amoA-AOA、amoAAOB和nirS达极显著差异（P＜0.01）。

水氮耦合效应对两次追肥后的土壤amoA-AOA和nosZⅠ基因影响达极显著水平（P＜0.01）。第一次追肥后，与其他处理相比，W1N2处理的nosZⅠ基因丰度最低，除W1N3和W2N3处理外，与其余处理均达显著差异。水氮耦合对第一和第二次追肥后nirS基因的影响分别达极显著（P＜0.01）和显著水平（P＜0.05），均以W3N2处理最高。水氮耦合效应仅对第一次追肥后的amoA-AOB、nirK和narG基因影响达到显著水平（P＜0.05）。第一次追肥后的nirK和narG基因丰度均以W2N2处理最高。与其他处理相比，W2N1处理在第一次追肥后降低nirK基因丰度达0.51%～6.37%，除W1N2处理外，与其他处理均达显著差异。W1N2处理的narG基因丰度最低，仅与W1N1和W2N2处理有显著差异。

2.4 水氮耦合对番茄产量和单位产量N2O、NO排放量的影响

图4是水氮耦合下对番茄产量和单位产量N2O、NO累积排放量的差异显著性分析。由图4a可知，水分、施氮量及水氮交互均极显著地影响番茄产量，影响效力表现为灌水下限＞施氮量＞水氮交互。灌水下限对产量的单一效应表现为灌水下限W2下，不同施氮量间差异不显著；W2和W3之间产量差异不显著，但显著大于W1。施氮量对产量的单一效应表现为随施氮量增加产量增加，灌水下限W1和W3下，N3水平显著高于N2和N1，而N2和N1差异不显著。水氮耦合效应使得番茄产量最高为W3N3处理，其次为W2N1处理。W2N1处理使番茄产量显著增加，与W1N1、W1N2、W1N3相比分别增加48.92%、50.69%和17.82%。

单位产量N2O、NO排放量可以用来反映作物产量与环境状况之间的关系。由图4b可知，水分、施氮量及水氮交互作用对单位产量N2O、NO及（N2O+NO）累积排放量均有显著影响，对单位产量N2O累积排放量效力大小表现为灌水下限＞水氮交互＞施氮量，对单位产量NO表现为施氮量＞水氮交互＞灌水下限，而对单位产量（N2O+NO）累积排放量表现为施氮量＞灌水下限＞水氮交互。灌水下限单一效应表明，单位产量N2O排放量表现为W1＞W3＞W2，差异显著；单位产量NO和（N2O+NO）排放量均表现为W1显著高于W2和W3，后二者差异不显著。施氮量单一效应表明，单位产量NO排放量表现为N3＞N2＞N1，差异显著；单位产量N2O和（N2O+NO）排放量均表现为N3和N2差异不显著，显著高于N1。水氮耦合使得W1N2处理的单产N2O和（N2O+NO）排放量最高，与其他处理差异显著。单位产量NO排放量最高为W2N3、W1N2和W1N3，而3个处理间差异不显著。W2N1处理的单位产量N2O、NO及（N2O+NO）排放量均最低，与其他处理差异显著。

2.5 水氮耦合下N2O和NO排放量与无机氮含量及功能基因丰度的关系

图5为土壤N2O和NO排放通量与无机氮含量及功能基因丰度的冗余分析（RDA），第一、二轴解释率分别为53.4%和1.7%，即总解释率达55.1%，以第一轴为主导轴。蒙特卡洛检验表明，第一轴（F=51.5，P=0.002）和所有轴的总和（F=6.9，P=0.02）差异显著。蒙特卡洛检验排序进一步表明，影响气体排放的影响程度由大到小排序为amoA-AOA、铵态氮、硝态氮和nirK。amoA-AOA、铵态氮和硝态氮均与N2O和NO排放通量之间存在极显著正相关关系（F=23.7，P＜0.01；F=21.6，P＜0.01；F=16.8，P＜0.01），分别解释土壤N2O和NO排放差异的31.3%、29.4%和24.4%。nirK基因与N2O和NO排放通量之间存在显著正相关关系（F=5.1，P＜0.05），对土壤N2O和NO排放差异的解释率为8.9%。

表3水氮耦合对硝化和反硝化基因丰度的影响[lg（copies·g-1土）]Table 3 Interactive effects of irrigation and nitrogen on gene abundance of nitrification and denitrification[lg（copies·g-1 soil）]

3 讨论

3.1 水氮耦合下设施土壤N2O和NO排放与番茄产量及单产（N2O+NO）累积排放量

温室作物产量除了受光照条件和温度等环境因素影响外，更依赖灌溉和施肥等人为调控因子[20]。水氮耦合下土壤水分和养分对产量影响差异显著，合理的水氮耦合可显著提高产量[21]。本研究中，灌水下限对产量的单一效应表现为W2和W3水平产量显著大于W1，灌水量过高，可能使灌溉水向下运移的同时增加了养分的淋溶损失，降低番茄产量[21]。相同灌水下限W2水平各水氮处理的番茄产量无显著差异，W1和W3水平各水氮处理表现为N3水平产量显著大于N1和N2，且N1、N2之间没有差异。本研究中，水氮耦合效应使W3N3的番茄产量最高，这可能是由于灌水下限W3水平下，相比其他处理土壤较为干旱，增施氮肥能够补偿一定水分胁迫对作物生长的抑制，进而促进干物质积累，获得较高产量。

在环境和粮食安全的背景下，探寻稳定或提高蔬菜产量的水肥管理至关重要，因此单位产量气体排放量常作为评估作物生产环境成本的一个重要指标[22]。在本研究中，W2N1和W3N1处理的单位产量N2O、NO及（N2O+NO）排放量均较低。有研究表明，合理运用滴灌施肥技术降低单次灌水量，通过提高水肥利用率可显著提高玉米产量，减少单位产量N2O和NO排放[23]。总体上，W1N2处理的单位产量N2O和（N2O+NO）排放量显著高于其他处理，这可能与灌水下限W1水平灌水量较高，氧气不充足，易通过反硝化作用产生N2O和NO排放有关。与其他处理相比，W2N1处理在保证番茄产量的同时，使单位产量N2O、NO及（N2O+NO）排放量均最低，是本试验中平衡环境和作物产量的最佳处理。尽管N1施氮量（75 kg·hm-2）远低于设施栽培普遍施氮量，但由于试验地连续多年施氮且同时配施有机肥，一定程度实现有机肥替代氮肥，减少土壤酸化引发硝化反硝化过程产生N2O和NO排放，在保证设施蔬菜养分需求的同时既能培肥土壤又能实现污染减排。

3.2 水氮耦合下设施土壤N2O和NO排放及其影响因素

RDA分析结果表明（图5），N2O和NO排放通量与amoA-AOA、铵态氮和硝态氮之间呈极显著正相关，这是由于土壤N2O和NO排放受amoA-AOA、铵态氮和硝态氮的作用较大，随着氮肥施入及水分作用均会增加硝化作用底物，硝化作用占据主导位置。土壤中高的amoA-AOA和amoA-AOB基因丰度可能会有效地将铵态氮转化为硝态氮，而硝态氮作为反硝化过程的底物，有利于土壤发生反硝化作用，未被及时吸收利用的氮素通过硝化或反硝化过程以气态氮（N2O+NO）形式损失[23-25]。在本试验中，相同灌水下限水平下，N2O和NO排放随施氮量的增加表现为N3＞N2＞N1，这与氮肥溶解后被作物吸收的同时可为硝化或反硝化作用提供大量底物有关，在此过程中引起大量的N2O和NO排放[26-28]。相同施氮量下，不同灌水下限N2O排 放 表 现 为W3（45 kPa）＞W1（25 kPa）＞W2（35 kPa），这可能与土壤氧气的相对含量显著影响N2O排放有关[29]。有研究表明，当WFPS超过70%时，由于土壤局部厌氧，土壤发生反硝化过程[30]；当WFPS超过80%时加快反硝化过程中N2O和NO的产生，此时N2O与含水量呈负相关，这与本研究中第47 d时N2O出现负排放峰的结果一致，可能原因是气体采集前1 d进行了灌溉，土壤中较高的含水量抑制了N2O向外扩散，使N2O在土壤中的滞留时间延长[31]。本研究中，灌水下限45 kPa下，氧气充足时可能加快硝化细菌反硝化过程中N2O排放[32-33]。有研究表明，在低pH、高氧含量和大量可利用性有机碳条件下，异养微生物利用有机氮或者无机氮（NH+4）通过氨氧化过程产生N2O，同时硝化产物还可以进一步发生反硝化作用，从而产生大量的N2O和NO，因此，除土壤自养硝化过程，特定环境下异养硝化-反硝化过程可能是灌水下限45 kPa下高排放通量的重要原因[29，34]。而灌水下限25 kPa时反硝化作用强烈，厌氧环境下施入氮肥可显著提高反硝化底物的有效性，加速氮素分解过程中N2O排放；相关分析结果表明，nirK基因丰度与N2O和NO排放通量呈正相关，土壤中存在的亚硝酸还原酶（nirK基因编码）将硝态氮或亚硝态氮转化为N2的过程中可能产生大量的N2O[35]。总体上，N2O和（N2O+NO）总累积排放量表现为W2N1处理最低，这可能是由于中水低肥条件对于氮素转化过程具有一定的调控作用，在氮肥溶解过程中促进作物对氮素吸收，显著降低底物氮含量，而土壤中氧气含量在此条件下保持相对平衡，从而抑制了硝化、反硝化以及异养反硝化过程，降低N2O和NO的产生。此外，本研究中，除W1N3处理，其余各处理NO/N2O均小于1（数据未列出），N2O和NO的产生可能以反硝化作用为主。本研究中，反硝化菌功能基因（nirS、nirK、nosZⅠ和narG）的丰度比硝化菌功能基因（amoA-AOA和amoAAOB）丰度略高，也进一步表明N2O和NO可能以反硝化产生为主。

前期试验中，相同施氮量下，不同灌水下限N2O排放表现为W1＞W3＞W2，与本试验结果相反（W3＞W1＞W2）。与前期研究结果相比，本试验总灌水量显著增加，在相同灌水下限条件下，灌水次数增多，土壤干湿交替频率升高，土壤含氧量的变化为异养硝化、自养硝化以及反硝化过程提供了适宜的环境条件[29]。有研究表明，pH和N2O排放呈负相关关系，低土壤pH值下易增加与反硝化有关的气体的产生[36]，这与本研究结果一致。与试验地之前结果（2017年）对比发现，本研究（2019年）土壤累积N2O排放量比之前增加1.5～1.9倍[15]。这与本研究连续定位施肥导致土壤酸化，土壤pH值降低有关（本研究pH值在5.8～6.6）。尤其施肥量大且灌水频繁更易使土壤pH降低，引发硝化反硝化强度增加，造成N2O和NO的产生[17]。

4 结论

（1）水氮耦合条件下，amoA-AOA、铵态氮含量、硝态氮含量和nirK基因丰度是影响N2O和NO排放的主要影响因素，均与N2O和NO排放通量之间存在极显著正相关关系，其影响作用依次降低。N2O和（N2O+NO）总累积排放量表现为W2N1处理最低，NO总累积排放量表现为W1N1处理最低。

（2）N2O、NO和（N2O+NO）总累积排放量及单产NO和（N2O+NO）累积排放量均表现为施氮量单一影响效力最大，而番茄产量及单产N2O累积排放量表现为灌水下限单一影响效力最大。本研究中W3N3处理产量最高，但过高氮肥投入显著增加了N2O和NO排放。除差异不显著处理，处理W2N1显著增加番茄产量14.86%～50.69%，且单产N2O和NO排放量分别降低40.00%～78.57%和21.43%～60.71%。

（3）综合番茄产量及N2O、NO减排效果，长期设施生产中，配施有机肥作为基肥，灌水下限35 kPa、施氮量75 kg·hm-2组合是实现设施生产经济及环境双赢的水氮管理模式。