QuEChERS/HPLC-MS法测定食品中的生物碱

邢海燕

(池州市食品药品检验中心，安徽 池州 247000)

罂粟碱在临床上主要用于缓解伴有动脉痉挛的大脑及外周血管疾病，可治疗脑血栓、肺栓塞、肢端动脉痉挛及动脉栓塞性疼痛等疾病。那可丁和蒂巴因都能从罂粟属植物鸦片中提取得到。那可丁为支气管解痉性镇咳药，其作用与罂粟碱相似；蒂巴因的药理作用与吗啡相反，它的痉挛毒性超过麻醉作用。可待因是一种鸦片类药物，可用于镇痛和镇静，长期应用亦可产生耐受性、成瘾性。吗啡为阿片受体激动剂，是临床解除剧烈疼痛的主要药物，其最大缺点是易成瘾，这使得长期吸食者无论从身体上还是心理上都会对吗啡产生严重的依赖性，导致严重的毒物癖，从而对自身和社会均造成极大的危害。这五种生物碱都属于精神药物。《中华人民共和国食品安全法》明确规定：“不得在食品生产中使用食品添加剂以外的化学物质和其他可能危害人体健康的物质。”食品中禁止添加罂粟碱、那可丁、蒂巴因、可待因、吗啡，但是依然有不法商家为了利润铤而走险，在火锅底料、卤味、麻辣烫等食品中非法添加这类物质，对消费者的身体健康造成极大危害。

目前，人们越来越重视食品安全问题，针对罂粟碱、那可丁、蒂巴因、可待因、吗啡等生物碱的检测建立了比色法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、液质串联法等方法。其中，液相-质谱串联法具有分离能力强、分析范围广、定性分析结果可靠、检测限低等优势。由于食品样品基质复杂，本研究选择火锅底料和半固体调味料这两种具有代表性且成分复杂的基质验证和优化检验方法。

1 材料

1.1 主要仪器

1290II/6470A三重四极杆液相-色谱-质谱联用仪，HC-3018高速离心机，KQ5200DE超声波清洗器，JA3103N分析天平(精确到0.001 g)，粉碎机，XW-80A微型涡旋混合器。

1.2 主要试剂

甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵，均为色谱纯；盐酸、无水醋酸钠、无水硫酸镁，均为分析纯；水为符合GB/T 6682规定的一级水。

1.3 仪器条件

1.3.1 液相条件

色谱柱：BEH HILIC色谱柱(Waters，粒径1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；进样量：5 μL；柱温：25 ℃；柱流速：0.3 mL/min；流动相：A相为含0.1%甲酸的甲酸铵溶液(甲酸铵浓度为5 mmol/L)，B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。按表1的程序进行梯度洗脱。

表1 液相梯度洗脱程序

续表1:

1.3.2 质谱条件

离子化方式：电喷雾电离；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：MRM多反应监测。

质谱优化后的方法条件具体见表2(带*为定量离子)。

表2 7种化合物的定性离子对、定量离子对、裂解电压及碰撞能量

2 方法和结果

2.1 样品QuEChERS前处理

称取试样2 g(精确至0.01 g)于50 mL带塞离心管中，加入60 μL 5.0 μg/mL的同位素内标工作溶液，液体样品和半固体样品可加入2 mL水，固体样品加入5 mL盐酸溶液。涡旋振荡40 s，然后准确加入乙腈15 mL，盖紧管塞，涡旋振荡1 min，再超声30 min 后取出。将6 g无水硫酸镁和1.5 g无水醋酸钠的混合粉末加入离心管，立即涡旋振荡 3 min，以吸附样品中的全部水分，以5000 r/min转速离心4 min，取上清液过0.22 μm的滤膜。取 1 mL续滤液进样，用于测定可待因、吗啡两种化合物；准确吸取500 μL续滤液至10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，混匀后进样，用于测定那可丁、蒂巴因、罂粟碱三种化合物。选取不含五种生物碱的火锅底料、半固体调味料作为空白样品基质，同时做空白实验，用于计算加标回收率。

2.2 标准溶液配制

分别吸取相应体积的混合标准储备液(那可丁、蒂巴因和罂粟碱的浓度为10 μg/mL，吗啡和可待因的浓度为50 μg/mL)于10 mL容量瓶中，用乙腈定容配制成所需的标准系列。那可丁、罂粟碱和蒂巴因的浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 ng/mL；可待因和吗啡的浓度分别为2.5、5.0、10、20、50、100 ng/mL。

吗啡-D3同位素和可待因-D3同位素混合标准溶液浓度为5.0 μg/mL，在标准系列中内标溶液浓度为20 ng/mL。

2.3 测定

2.3.1 定性测定

在相同的实验条件下分别测定标准溶液和样品溶液。如果样品溶液中检出的色谱峰保留时间和相应标准溶液色谱峰的保留时间一致，并且样品溶液的质谱离子对相对丰度与浓度相当的标准溶液的质谱离子对相对丰度相比较，相对离子丰度(k)允许的相对偏差在表3规定的范围内，即可以判定此样品中存在该组分。

表3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差范围

2.3.2 定量测定

取混合标准工作溶液进样，以那可丁、蒂巴因和罂粟碱三种化合物的色谱峰面积为纵坐标，以那可丁、蒂巴因和罂粟碱三种化合物的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，采用外标法定量；以可待因和吗啡的峰面积与相应内标物峰面积的比值作为纵坐标，以可待因和吗啡的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，采用内标法定量。

2.4 分析结果

2.4.1 五种化合物的提取离子质谱图

在上述的色谱和质谱条件下，五种化合物的标准物质提取离子质谱图见图1—图5。

图1 罂粟碱提取离子质谱图

图2 那可丁提取离子质谱图

图3 蒂巴因提取离子质谱图

图4 吗啡提取离子质谱图

图5 可待因提取离子质谱图

2.4.2 五种化合物的标准曲线

五种化合物的标准曲线见表4。

表4 五种化合物的标准曲线

2.4.3 加标回收结果

五种化合物的加标回收结果见表5。

表5 加标回收结果

3 结语

以火锅底料为空白基质时，罂粟碱、那可丁、蒂巴因的加标回收率为74.0%～102.3%，吗啡、可待因的加标回收率为75.7%～103.8%，均在回收率为75%～120%的准确度范围内。以半固体调味料为空白基质时，罂粟碱、那可丁、蒂巴因的加标回收率为75.0%～93.2%，吗啡、可待因的加标回收率为76.8%～105.9%，均在回收率为65%～120%的准确度范围内。

火锅底料和半固体调味料中的脂肪和盐含量高，添加成分多，基质复杂。本文中的QuEChERS前处理方法，操作简便，通过加标回收率验证，能够满足准确度的要求。