利用R基因RRS1/RPS4探索水稻原生质体瞬时表达转化体系的研究

李 丽，赵彦丰，吴琪琦，黄 燕

（四川农业大学生命科学学院，四川 雅安 625014）

植物历经漫长岁月，在与病原微生物的协同进化过程中逐渐形成了复杂的免疫系统，包括PTI（PAMP-triggered immunity）和 ETI（effector-triggered immunity）两大类[1]。其中，介导ETI反应的胞内受体被命名为抗性R（resistance）蛋白，根据其结构域的不同可以分为5大类，NLR（nucleotide bindingleucine rich repeat）类R蛋白数量最多且研究最为深入[2]。这类R蛋白因包含中心核苷酸结合位点和C端富含亮氨酸的重复序列而得名，根据N末端结构域的差异又可细分为TIR（toll-interleukin-1 receptor）NLR 即 TNL 型和 CC（coiled-coil）NLR 即 CNL型[3]。单个NLR R蛋白在多数情况下已经足以用于某一效应因子的识别和信号转导的活化[4-6]，但近年来的研究也鉴定出了多个需要配对才能正确行使功能的NLR蛋白对，例如CSA1/CHS3（constitutive shadeavoidance1/Chilling sensitive3）和 RRS1/RPS4（resistance toRalstoniaSolanacearum1/resistant toPseudomonas Syringae4）就需要相互结合后才能对多个不同效应因子进行正确识别，进而提高植物对不同病原菌的抵抗能力[7-11]。识别发生后，TNL型和CNL型R蛋白介导的通路分别依赖于EDS1（enhanced disease susceptibility 1）和 NDR1（non-race specific disease resistance 1）蛋白去激活下游信号转导，引起包括水杨酸积累、活性氧爆发、促病程相关基因表达等一系列免疫反应，最终诱发受侵染部位的细胞发生程序性死亡来有效地抑制病原菌生长和繁殖[12-13]。

以拟南芥（Arabidopsisthaliana）为代表的双子叶植物基因组中存在编码上述两种R蛋白类型的基因，而以水稻（OryzasativaL.）为代表的单子叶植物则仅存CNL型编码基因。有趣的是，尽管缺失了TNL型R蛋白，但其下游信号通路中的必须元件EDS1在单子叶植物中依然存在，且与双子叶植物的EDS1具有较高的序列同源性。在拟南芥中，EDS1蛋白作为植物免疫信号网络的关键调控点，既正调控植物对病原微生物的基础抗性，也是TNL介导ETI免疫应答不可或缺的组成部分，在基础免疫和ETI反应中都扮演着重要角色[14]。最新的研究揭示，与AtEDS1功能相似，OsEDS1也可能参与了水稻的基础抗病免疫反应[15-16]。那么，OsEDS1是否也参与ETI反应呢？为解答这一疑问，可利用水稻系统表达拟南芥中编码TNL的R基因，并检测这些R基因能否依赖水稻内源的EDS1去激活下游信号通路从而诱导与拟南芥相同或相似的抗病免疫反应。要实现将拟南芥基因导入水稻中进行功能研究，方法一般有两种：一是构建稳定表达的水稻转基因株系，该方法涉及组织培养技术，存在操作复杂、易染菌、筛选困难且周期长等问题；二是利用水稻原生质体对目标基因进行瞬时表达，该方法通过水稻自身的合成、修饰以及转运蛋白机制，短时间内可完成目的基因的高水平表达，得到的结果较可靠、具有一定的参考价值[17]。因此，利用水稻原生质体瞬时表达体系开展功能基因表达水平研究是一个可行且快捷有效的办法[16，18]。

目前，对于水稻细胞原生质体瞬时转化的研究主要集中在PEG介导的转化方法上，采用该法的水稻原生质体转化效率从40%～80%不等[19]。与电穿孔和显微注射相比，PEG介导法在植物原生质体转化中的应用较为广泛与成熟[20]。水稻因其木质部靠近表皮、厚壁细胞存在于维管束鞘与表皮之间等细胞结构的原因，原生质体提取比较困难，在相关报道中有通过水稻叶鞘、叶片、幼茎、悬浮细胞系等探索不同的提取、转化途径，但是尚没有最佳的水稻瞬时表达体系[17-18，21-22]。

本研究以日本晴野生型水稻的幼苗为试验材料，通过酶解法提取原生质体，并利用Box-Benhnken设计三因素三水平响应面试验，优化PEG浓度、质粒浓度和PEG介导的转化温度，分析各变量相互作用对原生质体转化效率的影响，从而获得最佳的转化体系组合。再利用本研究构建的水稻原生质体瞬时表达体系对拟南芥TNL型R基因—RRS1/RPS4能否诱导水稻下游抗病免疫的发生进行一个初步、快速的检测，为以水稻原生质体为实验平台的研究提供技术支持和数据参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 试验试剂

1/2 MS固体培养基；酶解液（0.6 mol/L甘露醇，10 mmol/L MES pH 5.7，1.5%Cellulase RS1，0.75%Macerozyme R10，0.1%BSA，1 mmol/L CaC12）；W5（154 mmol/L NaCl，125mmol/LCaC12，5mmol/L KC1，2 mmol/L MES pH 5.7）；MMG（0.6 mol/L 甘露醇，15 mmol/L MgC12，4 mmol/L MES pH 5.7）；培养液（0.6 mol/L mannitol，4 mmol/L MES pH 5.7，4 mmol/L KC1）；PEG 转化液（0.6 mol/L甘露醇，100 mmol/L CaC12，PEG-4000：30%、35%、40%）。RNA 提取试剂盒（EASYspin植物RNA快速提取试剂盒）、逆转录试剂盒（TaKaRa PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit）、实时荧光定量PCR试剂盒（SYBR®Green Realtime PCR Master Mix）。

上述试剂，纤维素酶Cellulose RS和离析酶Macerozyme R10购自日本YAKULT公司，甘露醇、CaCl2、MgCl2购自美国 Segma 公司、MES 购自索莱宝科技有限公司，其余试剂均为分析纯试剂、RNA提取试剂盒购自博迈德基因技术有限公司、逆转录试剂盒购自宝日医生物技术有限公司、实时荧光定量PCR试剂盒购自索莱宝科技有限公司。

1.3 试验设备

RDN型人工气候箱（东南仪器260B-4）；超净工作台（AIRTECH SW-CJ-ZFD）；超低温冰箱（Thermo UXF30086V）；恒温培养摇床（上海一恒THZ-300C）；电动分液器（Eppendorf SNP43151D）；高压蒸汽灭菌锅（SANYO MLS-3780）；台式冷冻离心机（Thermo SORVALL ST8R，Eppendorf Centrifuge 5804R）；生物荧光显微镜（OLYMPUS BX53）；HH-2数显恒温水浴锅（常州智博瑞仪器制造有限公司）；Kp-1型手提式真空泵（科亿隆实验设备有限公司）；超微量分光光度计（Thermo NanoDrop 2000）；实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD CFX Connect）、型稳流稳压电泳仪（BIORAD DYY-Ⅲ-6B）、型垂直板电泳槽（BIO-RAD DYY-Ⅲ）、凝胶成像仪（BIO-RAD Universal HoodⅡ）。

1.4 试验方法

1.4.1 水稻日本晴幼苗的培养

取健康的水稻日本晴种子剥去颖壳，75%乙醇消毒1 min，灭菌蒸馏水冲洗2次；加入5%的次氯酸消毒30 min，其间放入摇床中震荡。用灭菌蒸馏水在超净工作台中冲洗10次。接种于1/2 MS培养基中，在温度（25±3）℃、湿度40%、光照5 500 lx、12 h光照/12 h黑暗条件下培养10～14 d后，用于幼茎原生质体制备。

1.4.2 原生质体的分离

取健康的水稻幼苗，去根和叶，剩下部分切成0.5～1 mm的片段。将片段置于装有酶解液（需要过滤灭菌）的锥形瓶中，黑暗条件下，25℃，50 r/min的摇床上，酶解5 h，酶解期间，用显微镜检查酶解情况，酶解完全的原生质体呈现独立的、大而饱满的圆球状。

1.4.3 原生质体的纯化

酶解液中加入等体积的W5溶液，轻轻混匀，300目尼龙布过滤，收集滤液于50 mL离心管中，重复操作上述，直至滤液澄清。4℃，1 200 r/min离心5min收集原生质体。用真空泵吸去上清，加入W5重悬，离心，收集原生质体。将收集到的原生质体，利用血细胞计数器定量细胞计数，用MMG重悬稀释至2×106个/mL备用。

1.4.4 原生质体的转化

1.4.5 原生质体瞬时转化率单因素优化

以原生质体瞬时转化效率为指标，研究PEG浓度（30%、35%、40%），质粒浓度（0.5、1、2 μg/μL）和转化时温度（0、18、37℃）条件下对原生质体瞬时转化率的影响。试验设置3次重复。

1.4.6 原生质体瞬时转化效率计算

以单独转入HBT95启动子驱动的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）瞬时表达载体检测转化效率。按照公式计算转化率：原生质体转化效率=（激发光下发出绿色荧光的原生质体数/明场下所有原生质体数）×100%。

1.4.7 响应面试验分析

根据1.4.5单因素试验结果，根据Box-Behnken设计原理，以PEG浓度（A）、质粒浓度（B）和转化时温度（C）3个因素为自变量，以原生质体转化效率（Y）为响应值，设计三因素三水平实验，采用Minitab 17.1.0对试验数据进行分析。

1.4.8 预测转化条件的验证

根据响应面分析，得到最佳转化条件组合为PEG 浓度 36.16%、质粒浓度 1.72 μg/μL、转化温度37℃。通过试验对此条件组合进行验证。

1.4.9 水稻原生质体RNA的提取

使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒进行原生质体RNA的提取。为了富集足够多的原生质体用于RNA的提取，每个样品做6组平行，最后合成一管用于RNA提取，提取方法按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.10 逆转录

使用TaKaRa PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit对提取的RNA进行逆转录得到cDNA模板，逆转录方法按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.11 实时定量PCR检测目的基因表达

使用上述cDNA进行实时定量PCR反应，以水稻肌动蛋白基因（ACTIN1）为内参基因，检测水稻ETI下游抗病相关基因的表达水平。基因引物序列见表1，实时定量PCR反应体系见表2。

表1 基因引物序列Table 1 Gene and primer sequences

表2 实时定量PCR反应体系Table 2 Realtime PCR reaction system

实时定量PCR反应程序：预变性95℃，1 min，变性 95 ℃，15 s，退火 55 ℃，15 s，延伸 72 ℃，30 s，返回第二步循环（39次）熔解曲线65℃→95℃，每5 s升温0.5℃

2 结果与分析

2.1 水稻原生质体转化效率

表3 在不同条件处理下水稻原生质体中GFP的瞬时表达比较Table 3 Comparison of transient expression of GFP in rice protoplasts in different conditions

2.2 响应面试验设计与结果

为进一步阐明水稻日本晴茎部原生质体转化效率究竟如何受PEG浓度、质粒浓度和转化温度3种转化条件的影响，本研究采用Minitab 17.1.0对试验进行响应面设计，以原生质体转化效率为响应值（Y），考察 PEG 浓度（A）、质粒浓度（B）和转化温度（C）3个因素及因素间交互作用对响应值的影响（表4）。运用ANOVA分析，对表4中的试验数据进行多元回归拟合分析，得出水稻原生质体转化效率（Y）与 PEG 浓度（A）、质粒浓度（B）和转化温度（C）之间的二次多项回归方程模型：

Y=-6.560+40.59A+0.211B-0.017 30C-59.35A2-0.133 5B2+0.000 032C2+0.448AB+0.042 1AC+0.002 32BC

对上述拟合模型进行回归分析，可知PEG浓度、质粒浓度和转化温度以及它们之间的交互作用影响原生质体转化效率的情况，分析结果如表5所示。可以看出：模型P＜0.01，表明该模型影响极显著；模型中失拟项P＜0.01，表明模型能充分反映试验真实情况，回归模型合理；R-sq值为96.73%，说明二次多项式回归效果良好，可以用来预测原生质体转化效率的最优条件组合。

从各单因素对原生质体转化效率的显著性分析可以看出，单因素中质粒浓度（B）和转化温度（C）的P值分别为0.001和0.025，表明二者对原生质体转化效率具有显著影响；而PEG浓度（A）对应的P值为0.103，说明该因素对原生质体转化效率的影响不显著。因素间交互效应中，AB、AC和BC的P值分别为0.278、0.030和0.059，表明AC交互效应显著，而AB和BC的交互效应不显著。而F值用于评估各因素对原生质体转化效率的影响程度，根据该值大小我们得出结论：各因素对原生质体转化效率影响程度从大到小排序分别为质粒浓度、转化温度以及PEG浓度。

2.3 交互作用分析

为了进一步研究相关变量之间的交互作用，用Minitab 17.1.0软件对试验数据绘制响应面图（图1），在固定一个因素不变的条件下，分析另外两个因素之间的交互作用。在图1B、D、F中，X和Y轴表示两个因素参数Z轴表示转化效率。图1A、C、D为等高线图，它的密集程度和图形中心形状可以直观地反映出两变量交互作用的显著程度。由图1A和B可知，在转化温度为37℃条件下，转化效率随PEG浓度和质粒浓度的增加，呈现先增后降的趋势；由等高线的疏密分布及响应面的倾斜程度可知，二者的交互作用对转化效率有一定的影响，随响应曲面沿质粒浓度方向的曲面陡峭程度较PEG浓度方向更大，说明质粒浓度对转化效率的影响比PEG浓度更加显著，但是二者的交互作用对转化效率的影响并不明显。由图1C和D可知，当质粒浓度为1.72 μg/μL时，水稻原生质体的转化效率随PEG浓度增加，呈现出先增后降趋势，而随转化温度的增加，转化效率呈逐步递增的趋势；等高线较密、响应面较陡，说明PEG浓度和转化温度有交互作用，且对转化效率影响显著，响应曲面沿PEG浓度方向的曲面陡峭程度较转化温度方向更大，说明PEG浓度对转化效率的影响较转化温度更为显著。由图1E和F可知，当PEG浓度为36.16%时，转化效率随质粒浓度增加，呈先增后降的趋势；随转化温度增加，转化效率呈逐步递增的趋势；响应曲面平缓、等高线稀疏，说明转化温度与质粒浓度之间交互作用对转化效率的影响不显著，且响应曲面沿质粒浓度方向的曲面陡峭程度较转化温度方向更大，说明PEG浓度对转化效率的影响比转化温度更显著。

图1 PEG浓度、质粒浓度和转化时温度对原生质体转化效率交互影响的等高线图和响应面图Figure 1 Contour and response surface diagrams of the interaction of PEG concentration，plasmid concentration and conversion temperature on protoplast conversion efficiency

根据响应面分析，利用Minitab 17.1.0软件绘图以确定水稻原生质体转化最优条件组合。如图2所示，转化效率随着PEG浓度的增加逐渐升高，但在36.16%时达到最高，图像成抛物线型，所以转化的最佳PEG浓度为36.16%。同样，随着转入质粒浓度的增加转化效率不断上升，但在质粒浓度达到1.72 μg/μL时，达到转化效率最高值，且随着质粒浓度继续增加，转化效率反而降低，图像成抛物线型，说明质粒浓度的最佳水平为1.72 μg/μL。在0～37℃范围内，最佳转化效率出现在转化温度为37℃时，随着温度的增加转化效率可能会继续增加，也可能在37℃时就是峰值，但37℃及以上的温度对植物细胞具有胁迫作用。因此，预测得出水稻原生质体转化最佳条件组合为PEG浓度36.16%、质粒浓度1.72 μg/μL、转化温度37℃时转化效率最高可达71%。

图2 水稻原生质体最佳转化条件Figure 2 Optimum conditions for rice protoplast transformation

2.4 预测转化条件的验证

对响应面分析得到的最优转化条件组合：PEG浓度36.16%、质粒浓度1.72 μg/μL、转化温度37℃进行试验验证。结果如图3所示，转化后，明场观察原生质体个数为33，其中发光原生质体个数为25，转化效率达到75%，与预测相符。

图3 预测条件下水稻原生质体瞬时转化效率检测Figure 3 Detection of transient transformation efficiency of rice protoplasts under predicted conditions

2.5 实时定量PCR检测目的基因表达水平

为检测瞬时表达体系中R基因是否转化成功并诱发水稻的抗病能力，我们选取具有荧光的原生质体细胞提取总mRNA，以ACTIN1作为内参检测水稻抗病相关基因PR1a、PBZ1的相对表达水平。以单转空载质粒的原生质体为对照，结果发现分别瞬时表达RRS1、RPS4的单基因转化原生质体中OsPR1a的表达量比对照提高6～7倍左右（图4），OsPBZ1的表达水平也提高了3～4倍左右（图5）；而双基因共转化的原生质体中OsPR1a和OsPBZ1的表达水平则提高至27～28倍左右，差异达到极显著水平。该结果表明水稻原生质体中瞬时表达拟南芥TNL型R基因特别是共表达RRS1与RPS4时能显著诱导水稻ETI下游抗病相关基因PR1a、PBZ1的表达。

图4 水稻抗病基因PR1a在不同原生质体中的表达水平比较Figure 4 Comparison of expression levels of rice disease resistance gene PR1a in different protoplasts

图5 水稻抗病基因PBZ1在不同原生质体中的表达水平比较Figure 5 Comparison of expression levels of rice disease resistance gene RBZ1 in different protoplasts

3 讨论与结论

3.1 水稻原生质体培养和瞬时表达转化体系的最佳条件

本研究选取两叶一心期日本晴的茎部细胞进行原生质体的分离、培养和瞬时转化，成功获得了单基因和双基因的转化体。在最佳条件摸索中，我们发现水稻原生质体制备与苗龄和取材部位有较大关联。即种植后10～14 d内的植株能够得到数量较多、质量较佳的原生质体。同时由于水稻叶片的表皮与叶肉细胞木质部临近，维管束鞘和表皮之间具有较多的厚壁细胞，不利于酶解；而幼茎除了韧皮部、木质部及维管束鞘等较为坚硬的细胞外，多由薄壁细胞组成，以酶解法来制备原生质体较为容易。我们在原生质体个数大约为2×106个/mL时，取质粒量 10 μL，最终转化体系 210 μL，转化后培养12 h，得到最佳转化条件：PEG浓度36.16%、质粒浓度1.72 μg/μL、转化温度37℃时转化效率最高可达71%，且经过试验验证该转化条件下转化效率可达到75%左右。在试验过程中，PEG浓度对转化效率的影响较小，当PEG浓度在34%～40%之间时，转化效率都可达60%～70%，大多数文献中水稻转化试验都使用40% PEG[23-24]。而质粒浓度对原生质体转化效率影响较大，质粒浓度在1.5～2 μg/μL时转化效率较高，低于了1 μg/μL则显著降低转化效率。而此前对质粒浓度影响的研究发现，p35S-GFP质粒转化水稻幼茎及叶鞘的原生质体，当原生质体数1～5×106个/mL时，质粒浓度增加到5 μg/μL时，转化效率可达60%～70%[25]，达到相同转化效率较本文所用质粒浓度更高，而另有研究在原生质体个数1～5×104个/mL时，取质粒 10 μL，仅在质粒浓度为 0.7 μg/μL 时，转化效率可达60%～70%[24]。这些研究数据表明质粒的浓度对转化效率产生的影响可能与原生质体的个数相关，并不是单一的影响。由于前人报道，通过短暂42℃热激，室温5 min转至42℃5 min处理后能略微提高水稻原生质体转化效率[26]，因此，我们设置了冰浴和37℃两个对原生质体都有略微刺激性的温度，并发现两种温度处理与室温（18℃）相比，转化效率均有所提高，且在37℃热激下转化效率更高。

3.2 拟南芥TNL型R基因的导入可以提高水稻内源ETI下游抗病基因的表达水平

水稻作为单子叶植物生物学研究的模式植物，其在功能基因研究等方面也具有重要的作用。水稻基因组包含900多个病程相关（PR，Pathogenesisrelated）基因，其编码的PR蛋白根据其结构的不同可分为17个亚类。PR1家族的PR1a和PR1b的转录水平因易受病原菌诱导而常被选作ETI抗病反应发生的分子标记；PBZ1蛋白结构保守且功能多样，研究发现其在植物ETI免疫中也发挥着重要的作用[27-28]。因此，本试验选择PR1a和PBZ1作为水稻ETI途径的抗病标志基因。利用本研究构建的水稻原生质体瞬时表达体系，将拟南芥TNL类型R基因RRS1、RPS4分别单转或共转到水稻原生质体中，发现单转、共转均可以提高水稻内源PR1a和PBZ1的表达水平，并且共转的诱导作用更加显著。该试验结果表明，尽管水稻基因组缺失了TNL类型编码基因，但将拟南芥的这类基因在水稻原生质体中表达能够诱导其内源ETI下游抗病相关基因PR1a和PBZ1的表达，预示着OsEDS1也可能参与了ETI反应，因而拟南芥TNL类型R基因可以依赖水稻内源的EDS1去激活下游信号通路来诱导与拟南芥相同或相似的抗病免疫反应。根据本次瞬转结果，接下来，一方面我们将在水稻原生质体中瞬时表达其他的TNL类型R基，以测试该诱导作用是否具有特异性；另一方面通过构建表达TNL类型R基因对的水稻转基因株系，进一步解析其涉及的信号转导途径及参与元件，以期望鉴定筛选出更多的参与抗病的新基因，并通过对它们功能的解析来丰富禾本科作物抗病免疫的调控网络。