三甲散加减对晚期喉癌患者病灶组织增殖、凋亡和侵袭相关蛋白表达的影响

栗晓东 高仲军 何敬 翟浩 田亮

在头颈部恶性肿瘤中，喉癌发病率约占20%，且其发病率呈逐年上升趋势[1]。目前，喉癌发病机制尚不清楚，但普遍认为肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭是涉及多个基因和多条信号通路的复杂调控过程[2,3]。三甲散加减由三棱、穿山甲、鳖甲、莪术等制成的中药制剂，具有抗炎、抗肿瘤、调节免疫等作用[4,5]。本研究对晚期喉癌患者在同步放化疗基础上加用三甲散加减治疗，观察其对病灶组织增殖、凋亡和侵袭相关蛋白表达的影响，并以Wnt/β-catenin、PI3K/Akt信号通路为靶点探讨其作用机制，旨在为晚期喉癌的治疗提供理论和实践依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年10月至2020年10月张家口市第一医院和蔚县人民医院收治的晚期喉癌患者70例为研究对象，随机分为对照组和联合组，每组35例。对照组男20例，女15例；年龄38～72岁，平均年龄(56.66±9.45)岁；联合组男22例，女13例；年龄41～75岁，平均年龄(58.40±9.31)岁。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:①符合晚期喉癌诊断标准，并经病理检查确诊；②未接受过放化疗或其他治疗；③预计生存时间>3个月；④患者及家属签署知情同意书。

1.2.2 排除标准:①重要脏器功能障碍者；②临床资料不完整；③对本研究药物过敏者；④合并其他恶性肿瘤者；⑤意识障碍、精神疾病患者。

1.3 治疗方法 (1)对照组采用TPF方案(多西他赛注射液75 mg/m2,第1天静脉滴注；顺铂40 mg/m2，第1～3天静脉滴注；5-Fu 750 mg/m2，第1～5天静脉滴注)。化疗2个周期后行放疗。采用 6 MV 直线加速器X线照射颈后区，剂量为2.0 Gy/d，5次/周。(2)联合组在对照组基础上给予三甲散加减治疗。组方：三棱10 g、穿山甲15 g、鳖甲15 g、莪术10 g、海藻10 g、昆布10 g、落得打10 g、桃仁5 g、蝉衣5 g、红花5 g，1剂/d，水煎成400 ml药液，1剂/d，分早晚2次服用，连续治疗8周。

1.4 观察指标 采用Western blot测定喉癌组织增殖相关蛋白(STAT3、CyclinD1、c-myc)、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3)、EMT相关蛋白(N-cadherin、Vimentin、E-cadherin)、侵袭相关蛋白(CD44v6、COX-2、MMP-9)、Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信号通路关键蛋白表达。

2 结果

2.1 2组增殖相关蛋白表达比较 2组治疗前STAT3、CyclinD1、c-myc蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后STAT3、CyclinD1、c-myc蛋白表达均较治疗前显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且联合组治疗后STAT3、CyclinD1、c-myc蛋白表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组增殖相关蛋白表达比较

2.2 2组凋亡相关蛋白表达比较 2组治疗前Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后Bcl-2蛋白表达均较治疗前显著降低，Bax、Caspase-3蛋白表达均较治疗前显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且联合组治疗后Bcl-2蛋白表达低于对照组，Bax、Caspase-3蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组凋亡相关蛋白表达比较

2.3 2组EMT相关蛋白表达比较 2组治疗前N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后N-cadherin、Vimentin蛋白表达均较治疗前显著降低，E-cadherin蛋白表达均较治疗前显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且联合组治疗后N-cadherin、Vimentin蛋白表达低于对照组，E-cadherin蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组EMT相关蛋白表达比较

2.4 2组侵袭相关蛋白表达比较 2组治疗前CD44v6、COX-2、MMP-9蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后CD44v6、COX-2、MMP-9蛋白表达均较治疗前显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且联合组治疗后CD44v6、COX-2、MMP-9蛋白表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组侵袭相关蛋白表达比较

2.5 2组Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达比较 2组治疗前Wnt、β-catenin蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后Wnt、β-catenin蛋白表达均较治疗前显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且联合组治疗后Wnt、β-catenin蛋白表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 2组Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达比较

2.6 2组PI3K/Akt信号通路关键蛋白表达比较 2组治疗前PI3K、p-Akt蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后PI3K、p-Akt蛋白表达均较治疗前显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且联合组治疗后PI3K、p-Akt蛋白表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 2组PI3K/Akt信号通路关键蛋白表达比较

3 讨论

增殖异常和凋亡受限是肿瘤细胞的基本特征，也是恶性肿瘤发生发展的关键原因。STAT3是STAT家族的重要成员，持续激活的STAT3进入细胞核后通过调控靶基因的转录和表达发挥不同的生物学效应[6,7]。资料显示，活化的STAT3能够上调细胞周期相关蛋白(CyclinD1、CyclinB、c-myc等)表达，从而加速细胞周期进程及细胞恶性转化，而阻断STAT3活化能够下调CyclinD1表达并上调促凋亡蛋白Bcl-2表达[8]。Caspase-3是Caspase-3家族成员，其过度活化能够促进细胞凋亡[9]。Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡过程中发挥重要作用，其中促凋亡蛋白Bax通过增加线粒体膜通透性和细胞色素C释放促进细胞凋亡；抗凋亡蛋白Bcl-2能够抑制Caspase-3激活，从而抑制细胞凋亡[10,11]。本研究结果显示，2组治疗前STAT3、CyclinD1、c-myc、Bcl、Bax、Caspase-3蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后STAT3、CyclinD1、c-myc、Bcl-2蛋白表达均较治疗前显著降低，Bax、Caspase-3蛋白表达均较治疗前显著升高(P<0.05)，且联合组治疗后STAT3、CyclinD1、c-myc、Bcl-2蛋白表达低于对照组，Bax、Caspase-3蛋白表达高于对照组(P<0.05)。说明在常规放化疗基础上联用三甲散加减治疗晚期喉癌能够调控增殖、凋亡相关蛋白表达，从而抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡。

研究发现，EMT是肿瘤细胞获得侵袭能力并转移至远处脏器的主要原因[12,13]。EMT相关分子标志物包括E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等，EMT发生时E-cadherin表达降低，而N-cadherin、Vimentin表达增高[14]。CD44v6是一种细胞表面黏附分子，通过促进肿瘤细胞与基底膜结合参与肿瘤侵袭和转移；COX-2是与肿瘤细胞增殖和侵袭密切相关的细胞因子，其表达增高可导致肿瘤耐药，可作为评估预后的重要指标[15]；MMP-9是MMPs家族成员，通过降解细胞外基质和基底膜成分为肿瘤侵袭和转移提供条件[16]。本研究结果说明在常规放化疗基础上联用三甲散加减治疗晚期喉癌能够调控EMT进程，从而抑制肿瘤细胞侵袭和转移。

研究证实，Wnt/β-catenin信号通路的持续活化可导致肿瘤细胞过度增殖，并抑制其凋亡，在细胞癌变过程中发挥重要作用。研究证实，Wnt/β-catenin信号通路与宫颈癌、胃癌、肺癌、喉癌等多种恶性肿瘤发生发展密切相关[17,18]。另外，PI3K/Akt信号通路是体内调控细胞分化和代谢的重要通路。既往研究证实，卵巢癌、甲状腺癌、鼻咽癌等恶性肿瘤组织存在PI3K/Akt信号通路的异常激活，可通过调控Bcl-2、VEGF等蛋白表达参与肿瘤细胞增殖、凋亡和侵袭转移过程[19,20]。但是，三甲散加减能够通过调控Wnt/β-catenin、PI3K/Akt信号通路影响喉癌细胞增殖、凋亡和侵袭，目前尚未见报道。本研究结果说明三甲散加减联合同步放化疗治疗晚期喉癌能够抑制Wnt/β-catenin、PI3K/Akt信号通路的持续活化，从而抑制肿瘤细胞增殖、侵袭，并促进其凋亡。

综上所述，在常规放化疗基础上联用三甲散加减治疗晚期喉癌通过调控相关蛋白表达抑制肿瘤细胞增殖、侵袭，并促进其凋亡，机制与抑制Wnt/β-catenin、PI3K/Akt信号通路活化有关。