1株钩状木霉SX005的鉴定及其复合制剂对黄瓜和辣椒苗生长的影响

2021-06-30张锋涛张成廖文敏付岗张重远侯巨梅李培征刘铜

中国瓜菜 2021年2期

张锋涛张成廖文敏付岗张重远侯巨梅李培征刘铜

摘要：通过形态学和分子生物学相结合的方法，明确木霉菌株SX005的分类地位，并以该菌株的分生孢子粉为原料，分别与氨基寡糖素、矿源黄腐酸钾、壳寡糖、海藻精、FUNA-801进行复配，通过盆栽试验测定其复合制剂对黄瓜和辣椒苗生长的影响。结果表明，木霉菌株SX005为钩状木霉菌;其5种木霉复配制剂均能促进黄瓜和辣椒苗地上部分生长，且比单独施用木霉菌效果更好，其中氨基寡糖素与木霉菌复配的制剂对2种作物的地上部分生长促进效果最好，使黄瓜株高提高了172%，辣椒株高提高了59.56%。海藻精或壳寡糖与木霉菌复配的制剂可显著增加黄瓜根质量，氨基寡糖素或矿源黄腐酸钾与木霉菌复配制剂可显著增加辣椒根质量。本研究将为钩状木霉SX005复合制剂应用提供技术支撑。

关键词：黄瓜;辣椒;钩状木霉;SX005;促生

中图分类号：S642.2+S641.3 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）02-023-07

Identification of Trichoderma hamatum SX005 and effects of its six compound preparation on the growth of cucumber and pepper seedlings

ZHANG Fengtao1， ZHANG Cheng1， LIAO Wenmin2， FU Gang3， ZHANG Chongyuan1， HOU Jumei1， LI Peizheng1， LIU Tong1

（1. Engineering Center of Agricultural Microbial Preparation Research and Development of Hainan （Hainan University）， Haikou 570228， Hainan， China;2. Haikou R & D Center of Guizhou Yibaiyi Biotechnology Co.， Ltd， Haikou 570100，Hainan， China;3. Institute of Plant Protection Research， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007，Guangxi， China）

Abstract： The classification status of Trichoderma strain SX005 was clarified through morphological characteristics combined with molecular biology ， and the growth-promoting function of its compound preparation on cucumber and pepper seedlings was evaluated by pot experiments with T. hamatum SX005 conidia as raw materials， compounded with amino oligosaccharide， potassium fulvic acid， chitooligosaccharide， seaweed extract and FUNA-801. Results showed that the Trichoderma strain SX005 was identified as T. hamatum based on the characteristics of morphology and molecular biology. The five Trichoderma preparations could promote the growth of cucumber and pepper seedlings， and the effect was better than that of Trichoderma alone. The mixure of amino oligosaccharide and Trichoderma had the best promotion effect on the above-ground growth of the two crops， the plant height of cucumber and pepper increased by 172% and 59.56% respectively. The mixture of seaweed extract or chitosan and Trichoderma could significantly increase the root weight of cucumber， aminooligosaccharide or mineral potassium fulvic acid combined with Trichoderma could significantly increase the root weight of pepper. This study will provide technical support for the application of T. hamatum SX005 compound.

Key words： Cucumber; Pepper; Trichoderma hamatum; SX005; Promoting growth

黃瓜和辣椒是我国重的要经济作物，近年来，在设施栽培中过量施用化学肥料引起了土壤酸化、板结、重金属污染和次生盐渍化等问题，降低土壤肥力的同时污染生态环境[1-2]。而在肥料中添加含有特定功能的菌剂，制成微生物肥料可以抑制作物对重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，提高肥料利用率[3]。已有研究表明，在黄瓜和辣椒种植中施用微生物菌剂能显著提高产量、降低作物发病率[4-6]。木霉菌（Trichoderma spp.）是广泛存在于土壤、根围、叶围等自然生态环境中的一种真菌，它可以通过竞争、拮抗、重寄生和分泌次生代谢产物等方式抑制植物病原菌的生长，同时可以促进植物对养分的吸收利用，提高作物产量和品质，在现代绿色农业生产中被广泛使用[7-11]。目前，在木霉菌制剂的开发研究中因厚垣孢子发酵条件困难而产量较少，分生孢子发酵方法简单且产量高，所以市场上使用的生物制剂大多为通过固体发酵技术获得的分生孢子制剂[12-14]。单一使用木霉菌分生孢子对作物的促生效果一般，而将木霉菌分生孢子与营养物质或植物生长调节剂复配使用可以对作物的促生抗病起到协同增效作用[15]。氨基寡糖素、矿源黄腐酸钾、壳寡糖、海藻精等物质具有促进作物生长、抑制病原菌或诱导植物产生抗病性和提高作物产量和品质的作用，目前在农业生产中应用较为广泛[16-19]。但这类物质与微生物菌剂复配的效果研究报道较少。

海南省绿色农用生物制剂创制工程研究中心通过分离获得1株抑菌促生作用较好的木霉菌SX005，笔者拟通过形态学和分子生物学相结合的鉴定手段明确该菌株的分类地位，并将该菌株的分生孢子粉分别与氨基寡糖素、矿源黄腐酸钾、壳寡糖、海藻精、FUNA-801进行复配，测定了5种木霉菌复合制剂对黄瓜和辣椒苗生长的影响，以期获得对黄瓜和辣椒苗促生作用较好的新型木霉菌复合制剂，为进一步开发利用木霉菌提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试培养基与试剂 PDA培养基：马铃薯200 g;葡萄糖15 g;琼脂15 g;蒸馏水1 000 mL。

SNA培养基：KH2PO4 1.0 g;KCl 0.5 g;KNO3 1.0 g;MgSO4 0.5 g;葡萄糖0.2 g;蔗糖0.2 g;琼脂18 g;蒸馏水1 000 mL。

CTAB、DNA提取液（V酚∶V氯仿∶V异戊醇=25∶24∶1）、异戊醇、β-巯基乙醇、70%乙醇均购自于天根生化科技（北京）有限公司。

ProDis MC9、Wgwin DKF润湿剂、LT-8601润湿增强剂、元明粉、白炭黑均购于深圳市朗钛生物科技有限公司;矿源黄腐酸钾购于郑州银之海化工产品有限公司;氨基寡糖素、壳寡糖由青岛中科兴海生物有限公司提供;海藻精由北京劲善劲美农业科技有限公司提供，FUNA-801（0.1%）由郑州信联生化科技有限公司提供。

1.1.2 供试菌株与作物木霉菌SX005来源于海南海口白沙门附近海泥样品，经选择性培养基PDAm分离所得，保藏于海南省绿色农用生物制剂创制工程研究中心（海南大学）。黄瓜种子‘津丰A108购自海南晨锋种业有限公司;辣椒种子‘热辣4号由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供，黄瓜和辣椒苗由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所第五农场大队培育。

1.1.3 育苗基质育苗基质由泥炭、椰糠、炭化稻谷壳、蛭石组成，pH值为7.52，碱解氮质量分数112.81 mg·kg-1，有效磷质量分数48.06 mg·kg-1，速效钾质量分数374.95 mg·kg-1，有机质质量分数2.93%，购自广州市生升农业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌形态学观察将木霉菌株SX005从低温甘油转接到PDA平板上于28 ℃活化3 d，用6 mm打孔器沿菌丝生长边缘打成菌饼，将其接种于SNA培养基平板中心，培养7 d后观察其菌落形态、分生孢子、分生孢子梗及瓶梗的形态特征，参考Jaklitsch & Voglmayr[20]木霉菌分类方法进行鉴定。

1.2.2 木霉菌分子鉴定将木霉菌株SX005培养5 d后，刮取菌丝，采用CTAB法提取基因组DNA。以基因组为模板，利用上游引物（5'-TGGGGWGAYCAR AARAAGG-3）和下游引物（5'-CATRATGACSGAATCTTCCTGG-3）通过PCR技术扩增rpb2基因。其PCR擴增体系如下：基因组模板1.0 μL，正向引物和反向引物各1.0 μL、preMix 12.5.0 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR扩增反应条件如下：94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min 15 s，共35循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1.2%（w）琼脂糖凝胶电泳检测后，切取其目的基因片段，与Ti质粒连接，挑取阳性克隆送至广州基迪奥公司测序。SX005的rpb2基因序列已提交至NCBI的Genbank数据库（登录号 MW148290.1）。

使用DNAMAN软件将测序获得的rpb2基因进行拼接[21]，后提交至NCBI数据库进行BLAST同源比对分析，选择NCBI refseq数据库中的Hypocreales肉座目的12个同源性较高的rpb2序列（XM_006966461.1，XM_008600692.1，XM_008602683.1，XM_018804915.1，XM_023578311.1，XM_0311648- 34.1，XM_035463193.1，XM_031222262.1，XM_031185185.1，XM_031209139.1，XM_018898279.1，XM_018390099.1），使用Mafft软件进行多序列比对[22]。另外，使用HMMER 3.1基于隐马尔科夫 HMM模型，在拥有全基因组的木霉菌种中寻找rpb2代表性的同源序列（E值设定为1E-20）[23]。使用Mafft软件进行多序列比对，Gblocks软件选取保守区域[24]，Jmodeltest软件选择最佳的替代模型[25]，Iqtree软件进行基于最大似然法的进化树的构建[26]，最大似然法的boostrap值设置为1 000。所有用于建树的序列，都提交至MEME在线网站（http：//meme-suite.org/）来验证其保守序列[27]。

1.2.3 木霉菌孢子粉及复合制剂制备将钩状木霉SX005孢子悬浮液（浓度为1.0×108 CFU·mL-1）按0.5%的接种量接种于已灭菌的发酵基质中，发酵基质由麦麸、玉米粉、稻壳、硅藻土按体积比6.8∶0.5∶1.7∶1混合组成、含水量45%。利用浅盘固体发酵技术[28]在28 ℃条件下发酵10 d，之后将其风干、粉碎、过筛得到钩状木霉SX005的分生孢子粉（1.5×1011 CFU·g-1）。将得到的SX005分生孢子粉分别与氨基寡糖素、矿源黄腐酸钾、壳寡糖、海藻精、FUNA-801进行复配。

助剂组合体系如下：白炭黑60 g，ProDis MC9 60 g，Wgwin DKF润湿剂10 g，LT-8601润湿增强剂160 g，元明粉90 g。

1.2.4 促生试验促生试验于2019年11月在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所第五农场大队中进行。将黄瓜和辣椒种子用55 ℃温汤浸种的方法进行消毒，自然冷却晾干后播种育苗。待黄瓜苗长到二叶期、辣椒长到六叶期时，挑取长势一致的健康幼苗移栽到直径为12 cm的育苗盆中，浇定根水。试验采用随机区组设计，共设计7个处理，每个处理50株苗，3次重复，将单一木霉菌T1、复合制剂T2～T6与水以1∶300的体积比配制成T1～T6稀释液，在移栽第2天分别灌根处理，每株苗灌100 mL稀释液，移栽后7 d分别以同样的稀释液对植株进行第2次灌根处理，同时进行1次叶喷处理。对照组以100 mL清水处理。在第2次灌根处理后7 d，使用标尺调查植株苗的株高、根长，使用分析天平称量地上部分鲜质量、根鲜质量、并将根在105 ℃将根烘干至恒重后称量其干质量。

1.3 数据分析

使用显微镜奥林巴斯BX53进行木霉菌显微形态的拍摄，使用Adobe Photoshop CC 2017进行图片的拼接，采用Excel 2003和SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。采用Duncan法进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 木霉菌株SX005的形态学鉴定

木霉菌株SX005在SNA培养基上生长较慢，菌丝稀疏，生长3 d时半径为19.8 mm，4 d时形成少量灰绿色产孢簇，轮状排列，7 d时长满平板（图1-A）;分生孢子呈球形（图1-B），厚垣孢子为绿色，呈球形或椭球形（图1-C）。木霉菌株SX005在SNA培养基上无色素和明显气味，菌丝具有长的主轴，侧分支呈现较短的分叉;瓶梗呈现单生、对生或3个轮生，呈烧瓶形或安瓿形（图1-D～F）。以上木霉菌株SX005的形态特征与钩状木霉菌形态特征相似，因此推测该菌株为钩状木霉。

2.2 木霉菌株SX005的分子鉴定

为进一步确定该菌株是否属于钩状木霉菌，试验采用保守引物扩增了大约1.2 kb的rpb2基因片段，经回收克隆获得了1 294 bp的rpb2序列。基于Mafft软件的多序列比对结果，使用Gblocks软件，进行保守区域选择，共有707个建树简约位点被用于后续分析。使用Jmodeltest软件，进行替代模型选择，根据矫正后的池氏信息准则AICc，选择TIM2+G作为最优替代模型，使用iqtree软件进行基于最大似然法的进化树构建。

由图2可知，rpb2序列经过MEME软件保守结构域分析后，都具有10种保守的motif序列结构，相似的motif保守结构组成为系统发育分析结果准确性提供了更可靠的证据。在系统发育树中，木霉种归于8个进化枝，与目前已知的木霉菌系统进化关系描述一致。其中，Longibrachiatum Clade包括T. ghanense， T. longibrachiatum， T. saturnisporum和T. citrinoviride; Lutea Clade包括T. brevicompactum; Semiorbis Clade包括T. semiorbis; Harzianum Clade包括T. harzianum，T. afroharzianum和T. pleurotum; Stomoticum Clade包括T. rossicum; Pachybasioides Clade包括T. polysporum，T. parapiluliferum和T. piluliferum; Viride Clade包括T. atroviride， T. koningii， T. viridescens， T. paraviridescens， T. pararogersonii和T. gamsii; Hamatum Clade包括T. asperellum和T. hamatum;而木霉菌株SX005在系统发育树中，与T. hamatum属于同一分支，具有较高的同源性，推测该木霉菌属于钩状木霉，结合2.1中形态学特征鉴定，明确木霉菌SX005為钩状木霉。

2.3 木霉菌株SX005及其不同复合制剂对黄瓜生长的影响

由表2可知，施用木霉菌复合制剂均能显著促进黄瓜苗地上部分生长，且比单独施用木霉菌（T1）对株高及地上部鲜质量的促进效果更好。T2处理对黄瓜株高的促进效果最好，株高达57.42 cm，比对照提高了172%，且显著高于其他复合制剂处理;T2与T3处理对地上部分鲜质量促进作用最大，且二者之间没有显著差异。施用木霉菌复合制剂黄瓜根长均低于对照，且T2与T3处理根长与对照差异显著;除T2外，施用木霉菌复合制剂黄瓜根鲜质量均高于对照，且T6处理根鲜质量最大，为0.94 g，较CK显著提高了77.36%;各处理根干质量均高于对照，T1、T2及T3处理根干质量与对照无显著差异，T4、T5、T6根干质量与对照差异显著，其中T5处理根干质量最大，为0.14 g，较CK增加了100%。

2.4 木霉菌株SX005及其不同复合制剂对辣椒生长的影响

由表3可知，施用木霉菌复合制剂能显著促进辣椒苗地上部分生长，所有处理组株高和地上部鲜质量均显著高于CK与T1。其中T2处理辣椒幼苗株高值最大，为38.07 cm，较CK提高了59.56%;T2处理组地上部鲜质量最大，为6.82 g，较CK提高了145.32%。与对照相比，各处理均促进了根长生长，仅T1处理对辣椒幼苗根长的促进效果显著，而5种木霉复配制剂对根长影响较小，与CK之间差异不显著; T2、T3处理根干、鲜质量均显著高于CK，并优于其他木霉菌复合制剂处理，其中T2处理根鲜质量最大，达2.33 g，较CK提高了92.56%，T3根干质量最大，为0.29 g，较CK增加了45%。

3 讨论与结论

木霉菌是农业生产中应用最为广泛的生防菌之一，不仅可以防治植物病害，还可以促进植物根系对肥料的吸收，进而促进作物生长。因此，进一步开发木霉菌，将木霉菌与肥料等物质复配使用可获得更佳的促生效果[29]。李瑞霞等[30]研究发现，减施25%化肥同时配施木霉菌有机肥能改善土壤可耕种性，提高番茄的品质与产量。王晓婷[31]将哈茨木霉制剂与化肥配施可显著改良土壤性质，促进玉米、丝瓜、茄子的生长。张子颖等[32]研究发现绿色木霉与高碳基肥料配施可促进烤烟生长发育、降低发病率、提升烤烟品质。杨力凡[33]将深绿木霉突变菌株与秸秆腐熟发酵制成生物有机肥处理黄瓜，发现其株高、鲜质量、干质量均高于对照。陈立华[34]和黄新琦[35]也发现哈茨木霉有机肥可显著促进黄瓜植株生长。

氨基寡糖素是从海洋生物外壳中得到的一种寡糖类新型生物农药，具有防治植物病害、促进细胞活化、刺激植物生长的作用[36]。张洪山等[37]将氨基寡糖素作为叶面肥喷施于辣椒幼苗上，发现能显著促进植株的生长发育。彭昌家等[38]发现氨基寡糖素会促进辣椒的营养生长、株高增高和分枝增多，但同时也抑制生殖生长，减少果实的产量。矿源黄腐酸是一种从天然腐植酸中提取的短碳链分子结构物质，可以螯合钾离子，使作物对钾的吸收增加30%，还可以调节作物生理代谢，促进植物根际细菌、真菌、放线菌的繁殖，提高土壤生物多样性[39-40]。这与本试验中木霉菌复配制剂促进黄瓜和辣椒地上部分生长的结果一致。研究表明，氨基寡糖素或矿源黄腐酸钾与木霉菌复配均能较好地促进黄瓜和辣椒地上部分的生长，其中，氨基寡糖素与木霉菌复配更能促进黄瓜株高生长，而矿源黄腐酸钾与木霉菌复配则更有利于黄瓜地上部分鲜质量的增加。氨基寡糖素与木霉菌复配对辣椒幼苗株高及地上部分鲜质量均有较好的促生效果。因而，对于黄瓜、辣椒等以果实为主的作物，可将氨基寡糖素、矿源黄腐酸钾与木霉菌复配施用，以提高果实产量，但对此分析还缺乏复配增产试验的验证。

在根系生长方面，木霉菌复配制剂5种处理的黄瓜根长均低于CK和单一使用木霉菌，而黄瓜根干质量均高于对照;木霉菌复配制剂5种处理辣椒根长、根干鲜质量均高于CK。氨基寡糖素或矿源黄腐酸钾与木霉菌复配施用的辣椒干、鲜质量均高于FUNA-801（0.1%）、壳寡糖、海藻精的复配制剂，而对黄瓜根干、鲜质量的促进效果则表现相反。刘彩云等[41]发现含有绿色木霉的复合微生物发酵后与黄腐酸钾复配可显著促进水稻茎的生长，但对于水稻根长有一定抑制作用。这与本研究木霉菌复合制剂对黄瓜根长的抑制效果相近。在木霉菌复配试验中，对黄瓜根系促进效果最好是海藻精或殼寡糖与木霉菌复配。海藻精含有K、Ca、Mg、Fe、Zn等多种矿物质元素和维生素，同时含有细胞分裂素、生长素、酚类、甜菜碱等生长调节物质，可以促进根系发育，刺激根茎对土壤养分的吸收[42]。陈保宇[43]将海藻精与微生物菌剂复配施用促进了水稻对氮磷钾等养分的吸收，提高了分蘖能力并取得良好的增产效果。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物，具有活化土壤、促进种子萌发、提高作物抗逆性等多种作用[44]。于明革等[45]研究发现壳聚糖抑制了黄瓜根系的顶端优势，但改善了根的组成，提高了根系的吸收和合成能力。试验中还发现海藻精与木霉菌复配施用在抑制黄瓜根长的同时，还能促进侧根发育，大幅度增加根质量。

综上所述，在黄瓜栽培过程中，可在根系较弱时施用海藻精或壳寡糖与木霉菌的复配制剂，在苗期施用矿源黄腐酸钾或氨基寡糖素与木霉菌的复配制剂。在辣椒栽培过程中，则推荐施用矿源黄腐酸钾与木霉菌复配制剂。

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