RBP-4对妊娠期甲状腺功能减退子代肾线粒体功能的影响*

陈丹燕，甘 华，李 里，卢 松，王红漫，邓华聪，罗利伟

(1.重庆市人民医院/中科院大学重庆医院内分泌科 401147；2.重庆医科大学附属第一医院肾内科 400016；3.重庆医科大学附属第一医院内分泌科 400016)

随着社会经济水平的提高和碘盐的普及，全球甲状腺功能减退的发病率较前明显降低，但妊娠期甲状腺功能减退症的发病率仍高[1]。0.3%～0.5%的妊娠妇女患有临床甲状腺功能减退，2%～5%妊娠妇女患有亚临床甲状腺功能减退[2-3]。在妊娠前期(12～16周)母体甲状腺是胎儿生长发育所需的唯一甲状腺激素来源，即使母体发生轻微的甲状腺激素缺乏亦可导致后代神经发育缺陷、神经智力发生不可逆损伤[4-6]。因此，妊娠期甲状腺功能减退对子代影响的研究，主要集中在神经发育、学习记忆障碍和认知损伤方面，而对子代肾脏影响的研究相对较少。视黄醇结合蛋白(RBP)是新近发现的一种脂肪因子，由181个氨基酸残基组成，属于视黄醇结合蛋白家族中分泌型视黄醇结合蛋白。RBP4由肝脏合成并释放入血，通过与视黄醇、甲状腺素转运蛋白及细胞表面受体相互作用，参与代谢综合征、动脉粥样硬化和甲状腺功能减退等疾病的发生、发展[7-8]。然而，RBP4是否与妊娠期甲状腺功能减退患者子代肾脏线粒体功能障碍有关，以及对可能发生机制的研究国内外尚少见报道。本研究拟观测RBP-4对妊娠期甲状腺功能减退子代肾线粒体功能的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取SD大鼠共60只(雌雄比为2∶1，体重(200±20)g，购自重庆医学科学院实验动物中心)，雌鼠与雄鼠合笼交配饲养。交配后显微镜下观察雌鼠阴道涂片，若发现有精子则认为受孕成功。妊娠1周后将雌鼠随机分为3组：亚临床甲状腺功能减退组(SCH组)、完全甲状腺功能减退组(OH组)和正常对照组(CON组)进行造模。OH组：手术完全切除甲状腺，术后30 d眶后静脉丛取血测促甲状腺激素(TSH)和游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)，若TSH高于CON组、FT4<1.0 μg/dL(检测范围最小值)则提示造模成功；SCH组：在临床甲状腺功能减退大鼠模型建立成功的基础上，每天持续皮下注射1.0 μg/100 g左旋甲状腺素(L-T4，美国Sigma公司)，当血清TSH水平高于CON组、但FT4水平在正常范围时提示造模成功[9]；CON组：仅手术暴露甲状腺，不切除甲状腺。各组大鼠均于术后4～6 h喂食，为防止由于摘除甲状旁腺诱发低钙抽搐，术后饮水中加入1.5%葡萄糖酸钙。将雌鼠分娩当日定为P0天。母鼠于P1时眶后静脉丛取血，检测FT4、TSH，确保整个孕期造模均成功。各组仔鼠分别在出生后第14天(P14)、第35天(P35)称体重，分别测血肌酐、血清肾素、24 h尿蛋白水平。

1.2 肾脏线粒体的制备

将肾脏组织剪碎成肉糜样，用含有0.25 mg/mL胰酶的线粒体分离试剂悬浮碎组织块，加入清蛋白液至终浓度10 mg/mL均匀混合，4 ℃离心机低速离心移去上清液，加入线粒体分离试剂冲洗组织碎片，Dounee匀浆器匀浆，4 ℃离心机低速离心5 min。取上清液于另一离心管内，4 ℃离心机高速离心10 min，移去上清液，沉淀物即为线粒体，-70 ℃保存待用。

1.3 荧光定量PCR检测RBP4 mRNA表达

用TRIzol试剂盒提取鼠肾线粒体总RNA。参照逆转录试剂盒说明书，吸取2 μL RNA样品在10 μL 体系中进行反转录反应。取反转录产物1 μL 进行PCR扩增，PCR扩增体系为：5 μL 荧光定量染料2×SYBR荧光定量试剂、2 μL 引物(上下游各1 μL)、2 μL Plus反应液、1 μL cDNA。RBP4上游引物序列为：5′-TGGTATGCCATCGCCAAA-3′，下游引物序列为：5′-TCCCAGTTGCTCAGAAGA-3′；内参 β-actin上游引物序列为：5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物序列为：5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。扩增程序：95 ℃ 1 min后，进行95 ℃ 5 s，58 ℃ 5 s，72 ℃ 20 s，共47个循环。得到的Ct值以2-ΔΔCt法计算mRNA表达水平。

1.4 Western blot检测固醇调节蛋白-1c(SREBP-1c)、Netrin-1和RBP4表达

提取总蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。每孔上样50 μg总蛋白，加等体积2×加样缓冲液，100 ℃变性5 min，60 V电泳至样品进入分离胶，120 V电泳2 h，取出凝胶。将蛋白转移至硝酸纤维膜，3%脱脂奶粉稀释后的一抗4 ℃孵育过夜，0.05% Tris缓冲盐-Tween溶液室温漂洗后与3%脱脂奶粉稀释后的二抗37 ℃摇动孵育2 h，充分洗涤后硝基四唑氮蓝(NBT/BCIP)染色试剂盒显示蛋白印迹条带。图像分析(Quantity One图像分析系统，BIO-RAD)检测蛋白表达水平。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 发育期各组仔鼠的肾功能指标比较

发育期同一时间点各组间比较，同日龄的CON组与SCH组仔鼠血清肾素、血肌酐和24 h尿蛋白定量水平差异均无统计学意义(P>0.05)。与同日龄CON组仔鼠比较，OH组仔鼠血清肾素、血肌酐和24 h尿蛋白定量水平均增高，其中P14时两组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，但P35时两组组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。发育期不同时间点各组组内比较，P14时仔鼠血清肾素、血肌酐和24 h尿蛋白定量水平均显著低于P35时仔鼠(P<0.05)。见表1。

表1 各组仔鼠肾功指标结果比较

2.2 各组仔鼠SREBP-1c、Netrin-1和RBP4的表达及相关分析

P14和P35时，CON组仔鼠RBP4的mRNA和蛋白表达均显著低于OH、SCH组仔鼠(P<0.05)。P14时SCH组仔鼠SREBP-1c和Netrin-1蛋白表达与OH组差异无统计学意义(P>0.05)，而P35时SCH组仔鼠SREBP-1c和Netrin-1蛋白表达显著低于OH组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、2。OH组RBP4表达分别与SREBP -1c和Netrin-1呈正相关(P<0.05)。

图1 各组仔鼠RBP4 mRNA表达

图2 各组仔鼠SREBP -1c、Netrin-1和RBP4的表达

3 讨 论

妊娠期甲状腺功能减退对后代的影响是近年来妊娠内分泌领域的研究热点。已有研究表明，妊娠对母体甲状腺功能和体积会产生重大影响，主要表现为妊娠期间人绒毛膜促性腺激素(HCG)对TSH受体的刺激作用导致T4和T3增加；另一方面表现为妊娠期间甲状腺体积增大，且甲状腺素和每天碘的需求量增加[10-11]。若孕前已经诊断为完全或亚临床型甲状腺功能减退的患者，孕期甲状腺激素缺乏必将更严重。国外有学者[12-14]研究发现，妊娠期甲状腺功能减退患者经使用左旋甲状腺素替代治疗后，母代的血清肌酐水平通常可恢复正常，但对后代肾脏线粒体功能的影响目前研究尚不明确，这也是本课题组研究的重点。本研究发现，无论P14还是P35时，与同日龄CON组相比，SCH组仔鼠的血清肾素、血肌酐和24 h尿蛋白定量水平差异均无统计学意义(P>0.05)，而同日龄妊娠期OH组仔鼠的血清肾素、血肌酐和24 h尿蛋白定量水平高于CON组，其中P14时两组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，但P35时两组组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示，若母代甲状腺功能减退得不到有效控制，那么随着病情的进行性加重，子代可能出现肾脏功能损害。

甲状腺激素在胚胎发育过程中对肾脏起着重要作用。当机体内甲状腺激素水平持续降低时，细胞膜上Na+-K+泵的合成活性降低，外周血管阻力增加，靶器官或靶组织缺血，当累及肾脏时，肾血流量减少，肾小球滤过率降低，逐渐出现肾脏结构和功能损害，临床上表现为肾功能异常或蛋白尿，影响肾脏细胞膜的Na+/Ca2+转运体运转功能，诱发电解质代谢紊乱。若肾脏结构和功能发生改变，则反作用于甲状腺组织，甲状腺激素随尿液排出体外，促使甲状腺激素水平降低，诱发甲状腺功能减退。

线粒体是代谢性转化的重要节点，具有调控细胞生长和细胞周期的能力。在哺乳动物中，甲状腺激素是参与线粒体生物发生的最重要因素之一，可促进大多数线粒体蛋白编码基因的表达。另一方面，线粒体功能障碍可导致肾脏固有细胞损伤进而诱发细胞凋亡，同时加重肾脏的氧化应激损伤[15-16]。

新近研究发现，RBP4由肝脏合成并释放入血，可自由经肾小球滤过，几乎全部被近曲小管重吸收，甲状腺功能减退患者血清和尿中RBP4水平均增高[7-8]，这与本研究结果相一致。本研究进一步观测妊娠期完全和亚临床甲状腺功能减退组仔鼠RBP4的mRNA和蛋白表达水平，结果提示，无论P14还是P35时，CON组仔鼠RBP4的mRNA和蛋白表达均显著低于OH、SCH组仔鼠。

WANG等[17]研究发现，RBP-4通过抑制线粒体融合蛋白-1表达，增强线粒体分裂相关因子Drp-1、Fis1的表达，促进线粒体功能障碍的发生、发展。当线粒体功能障碍时，机体内基因编码的固醇调节分子蛋白-1c(SREBP-1c)的mRNA和蛋白表达水平增高，参与调节胆固醇合成和降解[18]，加重肾损伤。当肾损伤时，应激状态下的近曲小管过度表达Netrin-1。Netrin-1属于一种血管生成因子，对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞起促进增殖、迁移及黏附作用。Netrin-1过度表达不仅促进中枢神经系统血管新生，还可促进动脉血管及微血管形成，加速粥样硬化斑块进展[19]。

本研究发现，当妊娠期甲状腺功能减退时，子代SREBP-1c和Netrin-1的表达均明显上调，而且OH组SREBP-1c和Netrin-1的表达水平显著高于SCH组。进一步分析结果提示，RBP4的表达水平分别与SREBP-1c和Netrin-1呈正相关。推测妊娠期甲状腺功能减退时后代肾线粒体损害的可能发病机制是：RBP-4表达升高预警肾脏线粒体损害，线粒体SREBP-1c表达上调，促使Netrin-1显著聚集在电势降低的线粒体中自我激活，加速粥样硬化斑块进展，加重肾脏固有细胞损伤，进而诱发细胞凋亡，促使肾脏发生氧化应激损伤。

综上所述，RBP4可作为预测妊娠期甲状腺功能减退后代早期肾损害的重要因子，RBP4/SREBP-1c/Netrin-1信号通路活化可能通过参与调节妊娠期甲状腺功能减退仔鼠肾脏脂质代谢和血管生成，调控肾脏线粒体功能代谢，但本研究尚缺乏临床实验数据佐证妊娠期甲状腺功能减退后代肾脏线粒体损害的发病机制。