过氧化氢对兔离体左室复极相关电生理指标及心律失常的影响*

李云云 刘萌 张雪梅 薛小临 杨琳 严干新

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时,体内活性氧生成与抗氧化系统之间的平衡被打乱,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基产生过多和/或清除能力降低,氧化程度超出了氧化物的清除能力,从而导致氧化系统和抗氧化系统失衡,致机体发生一系列氧化损伤[1]。其中,ROS包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH)、过氧化氢(H2O2)等。H2O2活性较低,是一种非自由基类物质,有相对较长的半衰期,性质比较稳定,组织中作用范围广泛,可以允许其扩散至细胞膜,因此H2O2被广泛用于氧化应激的相关实验研究中。氧化应激时过量产生的ROS可通过活化丝/苏氨酸激酶-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ对单个心室肌细胞多种离子通道、泵、转运体、钙周期调控蛋白及缝隙连接蛋白等进行磷酸化修饰从而引起心肌细胞电活动紊乱,被认为是诱发病变心脏发生室性心律失常的可能的潜在的共同机制[2－5]。目前,氧化应激对心肌组织电活动影响的相关报道较少,因此笔者以冠状动脉灌注兔左室楔形组织块标本为研究对象[6],从组织水平上观察H2O2对兔离体左室复极相关电生理指标及心律失常的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 台氏液(mmol/L)：NaCl 129、KCl 4、CaCl21.8、Na H2PO4·2 H2O 0.9、MgSO4·7H2O 0.5、Na HCO320、C6H12O6·H2O 5.5。高钾台氏液(mmol/L)：KCl 24,余成份同台式液。上述液体均现用现配；过氧化氢(H2O2)购于美国Sigma公司。

1.2 冠状动脉(简称冠脉)灌注兔左室楔形标本制备 成年家兔,体重2.2～2.8 kg,由西安交通大学医学院动物中心提供。经兔耳缘静脉注射肝素抗凝后给予30%的乌拉坦(5 ml/kg)进行麻醉,开胸取出心脏,放入4℃高钾台氏液中。经左侧冠脉开口,插入冠脉插管至回旋支,固定插管后,灌注低温高钾台氏液,以去除冠脉内残留血液并使心脏停跳。修剪标本,制备左室楔形组织块,其标本宽约1.5～2.0 cm,长约2～3 cm标本。将标本放入恒温浴槽内,改用台氏液灌流,台式液温度维持在35.7±0.1℃,灌注压维持在35～45 mm Hg,持续向台式液中输入95%O2和5%CO2的混合气。起搏电极放置于心尖部内膜侧,给予约1 h频率为1 000 ms基础刺激,待稳定后用于后续实验。

1.3 实验分组及刺激流程 本实验为同一标本前后对照,首先给予标本灌注台式液及周长为1 000 ms基础刺激(basic cycle length,BCL)稳定1 h,之后继续灌注台式液,且给予相应程序电刺激(对照组,n＝12),刺激周长依次为2 000、1 000、500 ms,时间依次为7、1、0.5 min。待心电生理指标稳定(QT间期5 min内变化小于4 ms)后,再持续灌注1.0 mmol/L H2O2的台式液,且给予相应程序电刺激(实验组,n＝12),刺激周长和时间同对照组。

1.4 电生理指标记录与测量 跨壁心电图(ECG)的记录：将银-氯化银电极放置入台氏液中,电极的正极位于标本的外膜侧,负极位于标本内膜侧(与正常的跨膜心电向量方向相一致),距离心室组织块内(Endo)、外(Epi)膜侧约1.0～1.5 cm处。心室肌细胞动作电位(action potential,AP)的记录：用浮置玻璃微电极记录内外膜侧心肌细胞的AP。测量指标包括复极及跨壁复极离散度相关指标,QT间期为心电图上从QRS波开始至T波下降支与等电位线交汇处的时间间期；Tp-e(Tpeak-Tend)间期为T波顶点(Tpeak)到T波终点(Tend)(下降支与等电位线交汇处)的时间间期；Tp-e/QT为校正的Tp-e；实验组与对照组QT间期、Tp-e间期、Tp-e/QT比值的差值记录为ΔQT、ΔTp-e、ΔTp-e/QT；实验组与对照组相比QT间期、Tp-e间期、Tp-e/QT比值的变化百分比记录为ΔQT%、ΔTp-e%、ΔTp-e/QT%；同时还记录2 000 ms刺激下心内膜(Endo)及心外膜(Epi)早后除极(early after depolarization,EAD),晚后除极(delayed after depolarization,DAD)及体表心电图R-on-T室性早搏(简称室早)(频发为大于6次/分,偶发为小于6次/分)、室性心动过速(简称室速)及心室颤动(简称室颤)等心律失常。

1.5 数据分析及统计学处理 数据以均数±标准差表示。在不同BCL条件下,各电生理指标采取重复测量资料方差分析,组内比较采用自身前后配对t检验,率的比较采用配对卡方检验的Fisher′s确切概率法。以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 不同BCL刺激时两组电生理指标比较 两组QT间期、Tp-e间期均随BCL的增加而延长。然而,实验组的慢频率依赖性更加显著(图1、表1)。2 000 ms BCL刺激下与对照组相比,实验组QT间期、Tp-e间期明显延长。

表1 两组QT间期、Tp－e间期随不同基础刺激周长(BCL)的变化(n＝12)

图1 不同BCL刺激下两组QT间期、Tp-e间期的比较(n＝12)

2.2 2 000 ms BCL刺激下两组电生理指标比较2 000 ms BCL刺激下,对照组Tp-e/QT随时间无明显变化,实验组随H2O2作用时间延长Tp-e/QT比值呈先增大后减小的变化趋势,其值始终大于对照组,具体表现为：从H2O2充分作用开始,8 min时达效应峰值,Tp-e和QT间期同时延长且ΔTp-e%较ΔQT%增加显著,致Tp-e/QT比值随时间增大；继续延长观察时间,Tp-e和QT间期同时缩短且ΔTp-e%较ΔQT%下降显著,致Tpe/QT比值减小,但在观察时间内始终大于对照组(图2、表2)。

表2 实验组在2 000 ms BCL刺激下复极相关电生理指标随时间的变化(n＝8)

图2 实验组在2 000 ms BCL刺激下QT间期、Tp-e间期时间依赖性变化(n＝8)

2.3 两组发生EAD、DAD以及室性心律失常的比较 实验共12例标本,实验组有8例标本在2 000 ms BCL刺激下发生室性心律失常(vs对照组,n＝12,P＜0.001),其中6例发生EAD(2例频发、4例偶发)以及R-on-T室早,无室速及室颤发生(图3),其余2例频发EAD及R-on-T室早,并发生R-on-T室早触发的多形性室速及室颤(图4),实验过程中伴明显T波下降支切迹。对照组在相同的刺激条件下未观察到EAD、DAD及R-on-T室早、室速及室颤现象。

图3 2 000 ms BCL刺激下EAD、DAD及单次触发激动

3 讨论

氧化应激对心血管疾病的影响及其机制日益受到人们的广泛关注,其严重影响着高血压、心肌缺血/再灌注损伤、心力衰竭等心血管疾病的发生与发展[7－8]。笔者实验通过灌注H2O2观察氧化应激对离体兔左室心电图QT间期、Tp-e间期、Tp-e/QT等复极相关电生理指标的影响,并通过浮置玻璃微电极同步记录内外膜侧心肌细胞动作电位,探索H2O2与复极相关室性心律失常发生的可能的内在关系。

笔者利用H2O2刺激模拟体内氧化应激,发现H2O2可引起心电图QT间期、Tp-e间期延长,Tpe/QT增大,且呈现显著的慢频率依赖性,即就是心率减慢时这种变化特点更加显著。此外,实验同步观察到APD较长的内膜侧心肌细胞复极时间延长显著,2相平台期延长,复极易损窗增大,易诱发EAD及触发激动并向APD较短的外膜侧传导,进而利于跨室壁折返的产生和维持,从而促进心律失常发生。本结果提示：氧化应激状态合并慢心室率,内膜侧EAD触发机制可能是心律失常发生的启动因素,跨心室壁折返机制则可能是心律失常得以维持的关键。

有报道[9],氧化应激可引起心肌电-机械损伤,晚钠电流增强,细胞内钙超载,ATP-敏感性钾通道活化可能与该过程有关。本实验灌注H2O2条件下观察到,慢频率刺激时跨壁复极异质性的电生理指标有先增大后减小的时间依赖性影响,其表现可分为三个阶段：随H2O2作用时间延长QT间期延长、T波降支延缓伴切迹,同步记录单个心室肌细胞AP延长伴EAD、DAD及后收缩发生。继之QT间期缩短。实验继续延长观察时间,心肌细胞兴奋性丧失：细胞丧失兴奋性可能是由于随细胞外钾离子浓度升高达一定程度,静息电位减小到一定程度,进入失活的钠通道逐渐增多,阈电位会上移,使静息电位与阈电位的差值增大,兴奋阈值升高,细胞兴奋性降低达一定程度兴奋性丧失。本实验同步观察了跨壁心电图、心肌细胞动作电位形态时程的变化,若能同时增加对心肌收缩力及细胞Ca2＋瞬变的观察,对探索氧化应激时心肌电-机械活动变化的内在机制能提供更有利的实验证据。

总之,心血管病理状态,氧化应激水平升高,心电图QT间期、Tp-e间期、Tp-e/QT等无创性复极相关电生理指标呈慢频率依赖性变化,跨心室壁复极离散度增大,复极相关室性心律失常发生风险增加。本实验提示临床工作中应加强对心电图复极相关电生理指标的严密观察分析,可及早预测慢频率或间歇依赖的复极相关心律失常发生,以便有效措施及时干预,从而降低心血管恶性事件风险及不可逆性损伤。