糖分含量对番茄叶片Pst DC3000抗性的影响及其机理

赵 虎，张越亭，刘永华

(海南大学 园艺学院，海南 海口 570228)

番茄(Solanumlycopersicum)是世界上重要的蔬菜作物之一。据联合国粮农组织统计，2018年世界番茄总产量高达1.82 亿t，其中我国番茄总产量为0.62亿t，占比34%(FAO，2018)。番茄在实际生产中病害发生严重，其中Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000 (Pst DC3000)引起的细菌性叶斑病危害番茄叶片、叶柄、茎、花和果实，对番茄质量和产量均会产生严重不利影响[1-3]。该病害一般会导致番茄减产10%～30%，严重时达到50%以上[4]。Pst DC3000可在田间存活较长时间，并通过整枝、打杈、采收等相关农业活动进行传播或再侵染，病菌在田间进行多次重复再侵染，加重危害，防治较为困难[5]。田间长期使用杀菌剂不仅导致病菌产生抗药性，而且会造成环境污染和食品安全等问题。因此，亟需深入了解番茄对Pst DC3000的防御机制，以期培育出抗细菌性叶斑病的番茄新品种。

糖代谢在植物对病原菌的防卫反应中发挥着重要作用。一方面，糖代谢可为植物提供碳骨架和能量，用于细胞壁加厚、植物抗毒素的合成，以及抗病相关蛋白的积累等防卫反应[6]；另一方面，糖分(如葡萄糖和果糖)也可作为信号分子调节抗病相关基因表达[7-8]。除了增加植物的抗性外，糖代谢产生的葡萄糖和果糖也可以为病原菌的生长发育提供养分，从而导致植物发病[9]。因此，糖代谢在植物-病菌互作中发挥着双重作用，既可能增强植物抗性，也可能会促进病菌发育，导致植物发病。根据糖分对病原菌致病性的影响可将病原菌分为两大类：低糖病原菌(如番茄早疫病病原菌Alternariasolani)和高糖病原菌(如侵染禾本科作物的锈病和白粉病病原菌)，这两大类病原菌分别在植物组织中糖分含量低和高的时候显示出高致病性[10]。研究表明，改变植物组织中的糖分含量则会改变植物对相应病原菌的抗性。例如利用外源激动素马来酰肼(maleic hydrazide)处理提高番茄叶片中的糖含量，就会导致番茄叶片对低糖病原菌Alternariasolani的抗性增加[10]。然而，目前尚不清楚植物组织中糖分含量影响其抗病性的具体机制。

植物可通过光合作用把CO2转化为碳水化合物。在大部分植物中，蔗糖(sucrose，Suc)作为最终的光合产物通过韧皮部从光合叶片运输到各类库器官中(如果实、花、嫩叶、茎和根)。在植物体内，Suc只有分解为葡萄糖(glucose，Glc)和果糖(fructose，Fru)后才能被用于植物防卫反应或者被病原菌吸收利用[6，11]。植物体内参与Suc分解的酶主要分为两种：蔗糖合成酶(sucrose synthase，Sus)和蔗糖转化酶(invertase，INV)。Sus在细胞质内将Suc分解为 UDP-Glc和Fru，该反应为可逆反应，而INV则不可逆地将Suc水解为Glc和Fru[12-13]。依据亚细胞定位的不同，可将INV进一步细分为3种：细胞壁转化酶(cell wall invertase，CWIN)、液泡转化酶(vacuolar invertase，VIN)和细胞质转化酶(cytoplasmic invertase，CIN)[14]。

目前的研究主要集中在CWIN对植物抗病性的影响上，因为和其他3种蔗糖分解酶相比，CWIN在植物抗病性方面具有一定的特殊性：首先，CWIN通过在质外体空间将Suc分解为Glc和Fru，能够促进韧皮部中的Suc向病菌侵染部位的转运和卸载，进而为活性氧(ROS)积累、细胞死亡基因的诱导以及抗氧化化合物(包括谷胱甘肽、抗坏血酸和果聚糖)和防御信号分子(JA和SA)等的合成提供充足的糖分供应[9，14-17]。其次，CWIN在质外体空间水解Suc 生成的Glc和Fru可以作为信号分子激活植物抗病相关基因表达[9，14]。再次，病原菌可从植物质外体空间吸收CWIN水解蔗糖产生的Glc和Fru来维持其生长发育[11]。因此，CWIN可以通过调控质外体空间Suc的水解速度和己糖(Glc和Fru)的含量来影响病原菌的生长以及植物的防卫反应。

已有的研究表明，CWIN在植物抗病中的具体作用可能受到病原菌类型(死体营养型或活体营养型)的影响：CWIN在植物抗死体营养型病菌中发挥积极作用。例如，通过RNA干扰技术抑制烟草中CWIN的表达导致植株对死体营养型卵菌病菌Phytophthoranicotianae的抗性降低[17]。CWIN在植物抗活体营养型病菌中发挥着负面作用。例如，番茄CWIN基因LIN8的沉默不仅没有降低番茄植株的抗性，反而增加了对活体营养型细菌病菌Xanthomonascampestrispv.vesicatoria(Xcv)的抗性[18]。同样，通过超表达CWIN抑制因子的方法降低CWIN的活性导致拟南芥对活体营养型真菌病菌Plasmodiophorabrassicae的抗性增加[19]。此外，CIN也在植物抵御病菌侵染中发挥着重要作用。对小麦的研究表明，CIN基因Ta-A/N-Inv1的下调增强植株对条锈病病菌Pucciniastriiformis的抗性[20]。目前有关VIN和Sus在植物抗病中作用的研究则较少。推测植物组织中糖分含量对植物抗病性的具体影响可能与植物组织中转化酶的活性变化以及病菌的种类有关。

目前尚不清楚番茄叶片中的糖分含量变化是否会对其Pst DC3000抗性产生一定的影响及其具体的作用机制是否涉及到转化酶、ROS(如H2O2)和抗病激素水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)等。我们分别在早上8：00和晚上6:00对番茄叶片进行取样，对其在Pst DC3000抗性、淀粉和可溶性糖(Suc、Glc和Fru)含量方面的差异进行测定，以阐明番茄叶片中的糖分含量变化对其Pst DC3000抗性的影响；此外，通过对番茄叶片进行转化酶活性测定、H2O2原位染色以及SA和JA含量测定，以初步阐明糖分含量影响番茄叶片Pst DC3000抗性的生理生化机制，为下一步通过转基因和分子育种等现代生物技术手段提高番茄对Pst DC3000的抗性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用番茄品种为新疆农业科学院园艺研究所培育的新番2号。取40粒种子进行消毒灭菌处理：用 70%无水乙醇浸泡并振荡1 min，蒸馏水清洗2遍。然后用0.4%NaClO溶液浸泡5 min，蒸馏水清洗4遍。之后将种子放到底部垫有湿润滤纸的培养皿内，27℃恒温催芽5 d。待种子发芽后，再将种子播种至24孔的穴盘内，播种基质为2～6 mm 蛭石。待子叶长出来后，开始浇施1/2倍的园式营养液。栽培20 d后，将4叶1心的番茄苗移栽至混合基质中(土∶泥炭∶蛭石体积比4∶1∶1)，于海南大学园艺学院蔬菜实验教学基地锯齿温室盆栽种植，并施用一定量复合肥(N15%，P2O515%，K2O 15%)作为基肥。之后每2 d浇一次水，番茄大约生长5周后，从番茄植株顶端往下选取第3～4叶位上大小和形状差异不大且叶面较为平整的叶片进行Pst DC3000接种实验。

1.2 方法

1.2.1 病菌的培养和接种方法

接种Pst DC3000的方法参照Katagiri等[21]并适当调整。在超净工作台内，用灭过菌的牙签将平板上的Pst DC3000菌落刮下来，移到100 mL锥形瓶中，加入液体KB培养基50 mL，在温度为28 ℃，180 r·min-1的黑暗条件下进行摇菌培养36 h。将上述50 mL液体培养基用水平离心机在2 500×g下离心10 min，倒去上清液，得到细菌沉淀，加入无菌水将细菌沉淀制成悬浮液并将细菌浓度调整为2×108CFU·mL-1用于离体接种实验。

具体离体接种方法如下：在直径为11 cm的塑料培养皿中倒入70 mL质量分数为0.8%的琼脂，待琼脂冷却凝固。用蒸馏水将番茄叶片的表面清洗干净，并用吸水纸将叶面的水吸干，用镊子夹取清洗好的叶片整个浸没在上述浓度菌液中10 s，对照则浸没在无菌水中。然后将上述叶片的叶柄插入培养皿的琼脂中并保持叶片表面平整。封口膜密封后，在 23 ℃下培养2 d(黑暗8 h，18 ℃；光照16 h，4 000 lx，23 ℃)。对接种后0、24、48 h分别进行观察并取样，取样时以接种部位为中心，称取0.15 g样品，液氮速冻后在-80 ℃保存，用于测定蔗糖转化酶活性、可溶性糖和淀粉含量、SA和JA含量等。每个处理均包含4个生物学重复。

1.2.2 蔗糖转化酶活性和可溶性糖含量的测定

INV活性的测定参照Tomlinson[22]的方法; 蔗糖、葡萄糖、果糖含量的测定参照King等[23]的酶学方法。

1.2.3 细胞死亡染色和激素的测定

番茄叶片在接种后0、24和48 h进行细胞死亡染色，具体方法参照 Bai等[24]的方法。将番茄叶片在1∶1的乙醇和染色液(将10 mL乳酸、10 mL甘油、10 g苯酚和10 mg台盼蓝溶于10 mL蒸馏水中)配制的混合液中煮沸5 min进行染色，然后在2.5 g·mL-1的水合氯醛溶液中进行脱色处理，最后对叶片进行拍照。游离态SA、结合态SA以及JA含量的测定参照Yin等[25]方法。

1.2.4 淀粉和H2O2原位染色

叶片淀粉染色参考 Sosso等[26]的方法。将番茄叶片在95%乙醇中煮沸30 min将叶绿素完全去除，然后将叶片在I2-KI溶液(将1 g碘和1 g碘化钾溶于100 mL水中) 中染色5 min，然后用清水浸泡30 min后再冲洗2次，最后进行拍照记录。叶片H2O2染色参考 Thordal-Christensen等[27]的方法，将番茄叶片放入1 mg·mL-1的DAB(3，3′-diaminobenzidine)溶液中，在-80 kPa下抽真空7 min(共重复3次，中间轻轻振荡去除叶片表面的气泡)，然后避光室温下放置30 min。最后在95%乙醇中煮沸10 min去除叶绿素后进行拍照，存在H2O2的部位在染色后呈棕红色。

1.3 统计分析

利用Excel 2010软件对试验数据进行作图并用SPSS软件进行t-test分析。

2 结果与分析

2.1 早、晚取样叶片在Pst DC3000抗性上的差异

分别在早上8：00和晚上6：00对番茄叶片进行取样，然后立即对其进行离体病菌接种，分别于接种后24、48 h对番茄叶片的发病情况进行观察。结果发现，早上取样叶片在接种后24 h即出现叶片轻微皱缩和局部发黄的症状，在接种后48 h可观察到明显的褐色病斑(图1-A)；但晚上取样叶片在接种后24和48 h均未出现明显病斑，只是在接种后48 h出现轻微的皱缩现象。

在此基础上，进一步对早、晚取样叶片进行台盼蓝染色，以观察接种Pst DC3000后叶片中细胞死亡情况(图1-B)。在接种后0 h，早、晚取样叶片均未出现蓝色的细胞死亡信号；接种后24 h，早、晚取样叶片都出现蓝色的细胞死亡信号(图1-B中箭头所示)，且早上取样叶片的蓝色信号出现的范围要大于晚上取样叶片；接种后48 h，早、晚取样叶片都出现蓝色的细胞死亡信号均进一步加重，且早上取样叶片加重的程度明显高于晚上取样叶片。值得注意的是，虽然晚上取样叶片在接种后24 h未出现明显的病斑，但是已经发生细胞死亡现象。此外，我们对接种后叶片中的Pst DC3000细菌密度进行了测定，结果发现，接种0 h，番茄叶片中检测不到Pst DC3000细菌的存在，但在接种后24和48 h番茄叶片中的细菌密度快速上升，且早上取样叶片中的细菌密度极显著(P≤0.01)高于晚上取样叶片(图1-C)。总之，对叶片病斑、细胞死亡和细菌密度的测定表明，晚上取样叶片对Pst DC300的抗性要高于早上取样叶片。

A和B中标尺均代表 1.25 cm；B中箭头表示蓝色细胞死亡信号出现的部位；C中**表示早、晚取样叶片之间存在极显著(P≤0.01)差异。All scale bars in A and B represented 1.25 cm; Arrows in B indicated blue signals of cell death; ** in C indicated significant (P≤0.01) differences between morning- and evening-sampled leaves.图1 接种Pst DC3000后0、24和48 h番茄叶片病斑、细胞死亡和细菌密度的动态变化Fig.1 Dynamic changes in disease lesion，cell death and bacteria density in tomato leaves at 0，24 and 48 h after inoculation with Pst DC3000

2.2 接种后早、晚取样叶片在淀粉和可溶性糖含量上的差异

首先对接种后的叶片进行淀粉原位染色(图2-A)。结果表明，在接种0 h时，早上取样叶片中的蓝黑色淀粉信号主要集中在叶片中间部位，在叶片边缘局部位置的蓝黑色淀粉信号较弱，而晚上取样叶片的淀粉在整个叶片范围内分布较均匀。接种后24、48 h，早、晚取样叶片中的淀粉信号均随接种时间延长而下降，且早上取样叶片淀粉信号随接种时间增加消失更为明显，至接种后48 h淀粉信号基本消失，而晚上叶片内的淀粉信号消失较慢，至接种后48 h仍有较强的淀粉信号。在整个接种时期内(0～48 h)，晚上取样叶片中的淀粉信号一直高于早上取样叶片。为验证上述结果，我们对接种后叶片中的淀粉含量进行定量测定，结果发现，晚上取样叶片中的淀粉含量极显著高于早上取样叶片(P≤0.01)，在接种后0、24和48 h，晚上取样叶片的淀粉含量分别为早上取样叶片的133%、268%和529%(图2-B)。

A中标尺均代表 1.25cm；B中**表示早、晚取样叶片之间存在极显著(P≤0.01)差异。All scale bars represented 1.25 cm in A; ** in B indicated significant(P≤0.01) differences between morning- and evening-sampled leaves.图2 接种Pst DC3000后早、晚取样叶片淀粉原位染色和含量上的差异Fig.2 The differences of morning- and evening-sampled leaves in in situ starch staining and starch content after inoculated with Pst DC3000

在接种后0、24 h，晚上取样叶片的葡萄糖(Glc)含量分别显著(P≤0.05)、极显著(P≤0.01)高于早上取样叶片，前者分别为后者的451%和445%(图3-A)；但在接种后48 h，则表现为晚上取样叶片显著(P≤0.05)低于早上取样叶片。在接种后0h，早上取样叶片和晚上取样叶片的果糖(Fru)含量无显著差异；但在接种后24～48 h，由于早上取样叶片的Fru含量持续下降，而晚上取样叶片的Fru含量基本没有明显下降，最终导致在接种后24和48 h晚上取样叶片的Fru含量显著(P≤0.05)高于早上取样叶片(图3-B)。与Glc和Fru不同，接种后0～48 h番茄叶片中的蔗糖(Suc)含量不但没有下降，反而呈现上升的趋势，且在接种后0～48 h内，早、晚取样叶片的Suc含量没有显著差异(图3-C)。

此外，早、晚取样叶片在己糖/蔗糖比值上也存在较大的差异，晚上取样叶片的己糖/蔗糖比值在接种后0和24 h显著(P≤0.05)高于早上取样叶片(图3-D)，但在接种后48 h无显著差异。总体来讲，和早上取样叶片相比，晚上取样叶片在接种后具有较高的淀粉和己糖含量以及己糖/蔗糖比值。

图中*和**分别表示早、晚取样叶片之间在0.05和0.01水平上存在显著差异。下同。* and ** indicated significant differences between morning- and evening-sampled leaves at 0.05 and 0.01 levels，respectively. The same as below.图3 接种Pst DC3000后早、晚取样叶片在可溶性糖含量和己糖/蔗糖比值上的差异Fig.3 Differences of morning- and evening-sampled leaves in soluble sugar content and hexose/sucrose ratio after inoculated with Pst DC3000

2.3 接种后早、晚取样叶片在INV活性上的差异

大量研究表明，转化酶(INV)在植物抗病中发挥着重要的作用[9，28]，因此，我们对早、晚取样叶片在接种Pst DC3000后的3种INV活性进行了测定。结果表明，接种后早、晚取样叶片的细胞壁转化酶(CWIN)活性均呈现先上升后下降的趋势(图4-A)；但晚上取样叶片的CWIN活性在接种后0和48 h分别极显著(P≤0.01)、显著(P≤0.05)低于早上取样叶片。此外，早、晚取样叶片的细胞质转化酶(CIN)在接种后0 h无显著差异，但由于早上取样叶片的CIN活性在接种后24～48 h呈现不断下降的趋势，而晚上取样叶片的CIN活性在接种后呈现上升的趋势，最终导致晚上取样叶片的CIN活性在接种后24和48 h显著(P≤0.05)高于早上取样叶片(图4-B)。早、晚取样叶片的液泡转化酶(VIN)活性在整个接种期间无显著差异(图4-C)。总体来说，接种后早、晚取样叶片在CWIN和CIN活性上存在显著差异，这可能是导致两者在抗病能力上存在差异的重要原因。

图4 接种Pst DC3000后早、晚取样叶片在转化酶活性上的差异Fig.4 Differences of morning- and evening-sampled leaves in invertase activities after inoculated with Pst DC3000

2.4 接种后早、晚取样叶片在H2O2积累上的差异

植物在受到病菌侵染后往往会导致H2O2含量的上升，从而起到杀灭病原菌，阻止发病的作用[29]。但过量的H2O2则会导致植物细胞死亡，加速发病过程。通过对接种后叶片中的H2O2进行原位染色，我们发现在接种后0h，早、晚取样的叶片中都没有检测到明显的H2O2信号(图5)；在接种后24 h，在早、晚取样叶片的局部均出现微弱的棕色H2O2信号(如图中箭头所示)且早、晚叶片之间差异不大；而在接种后48 h，两种叶片中的H2O2信号均呈现显著增加的趋势，其中晚上取样叶片增加的幅度要明显低于早上取样叶片，导致早上取样叶片中的H2O2信号强度显著高于晚上取样叶片。

图A中标尺均代表 1.25 cm，图B中*和**分别表示早、晚取样叶片之间在0.05和0.01水平上存在显著差异。All scale bars in A represented 1.25 cm； * and ** in B indicated significant differences between morning- and evening-sampled leaves at 0.05 and 0.01 levels，respectively.图5 接种Pst DC3000后早、晚取样叶片在H2O2原位染色、SA和JA含量上的差异Fig.5 Differences of morning- and evening-sampled leaves in in situ H2O2 staining and the content of SA and JA after inoculated with Pst DC3000

2.5 接种后早、晚取样叶片在SA及JA含量上的差异

植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)在植物抗病性中发挥着重要的作用[30-31]。利用高效液相色谱法对接种后48 h番茄叶片中的SA和JA含量进行了测定。结果表明，接种后48 h，晚上取样叶片的游离态SA含量显著(P≤0.05)高于早上取样叶片，JA含量极显著(P≤0.01)高于早上取样叶片，但晚上取样叶片的结合态SA含量极显著(P≤0.01)低于早上取样叶片(图5-B)。推测早、晚取样叶片在游离SA和JA含量上的差异可能也是导致两者在抗病性上存在差异的重要原因之一。

3 讨论

蔗糖代谢不仅能为植物的防卫反应提供能量和碳骨架，用于各类抗菌物质的合成，其分解产生的葡萄糖和果糖也可作为信号分子调控植物相关抗病基因的表达[6]。此外，植物组织中的己糖(主要是葡萄糖和果糖)还是绝大部分的病菌生长发育所需的养分和能量。因此，植物组织内糖分含量的高低不仅会影响植物的抗病能力，还会影响病原菌的生长繁殖。根据病原菌对植物组织内糖分含量的要求，病菌可分为高糖病原菌和低糖病原菌[10]。本研究结果表明，和早上取样叶片相比，晚上取样叶片对Pst DC3000具有更高的抗性，表现为较轻的病斑和细胞死亡现象，同时叶片内的细菌密度也极显著降低(图1)。对接种后叶片中淀粉和可溶性糖含量的测定表明，晚上取样叶片的淀粉含量在接种后0～48 h内均极显著高于早上取样叶片(图2)；此外，晚上取样叶片在接种后0和24 h的葡萄糖含量以及24 h和48 h的果糖含量也显著高于早上取样叶片(图3-A、B)。虽然接种后早、晚取样叶片的蔗糖含量没有显著差异(图3-C)，但总体来讲，在整个接种时期内(0～48 h)，晚上取样叶片具有相对较高的碳水化合物含量，这表明Pst DC3000可能属于低糖病原菌，晚上取样叶片中糖分含量升高可能是导致番茄对Pst DC3000的抗性增强的重要原因。

早、晚取样叶片不仅在淀粉和可溶性糖含量上存在较大差异，而且两者在转化酶活性上也存在较大差异。具体来讲，晚上取样叶片在接种后0和48 h的CWIN活性显著低于早上取样叶片，而接种后24和48 h其CIN活性则显著高于早上取样叶片(图4-A、B)，但早、晚取样叶片在VIN活性上无显著差异(图4-C)。已有的转基因证据表明，CWIN在植物抗病中发挥着重要作用，且 CWIN在植物抗死体营养型病菌中发挥积极作用[17]，但在植物抗活体营养型病菌中发挥着负面作用[18-19]。由于Pst DC3000也属于活体营养型病菌[31]，因此我们推测晚上取样叶片对PstDC3000抗性的增加在很大程度上与其具有较低的CWIN活性有关。可能的机制有两个：首先，CWIN可影响抗病激素SA和JA的合成。研究表明，植物CWIN活性和SA含量之间呈负相关，例如，玉米的CWIN突变体miniature籽粒中的CWIN活性几乎完全消失，但其SA含量上升了10倍[32]。同样，利用外源施用阿卡波糖(acarbose)的方法降低拟南芥叶片中的CWIN活性导致其SA水平大幅上升[33]。本研究结果表明，伴随着CWIN活性的降低，晚上取样叶片中不仅具有较高的游离SA含量，同时也具有较高的JA含量(图5-B)。研究表明，增加空气中的CO2浓度可通过增加番茄叶片中的SA和JA含量来提高番茄叶片对Pst DC3000的抗性[34]。因此，可以认为晚上取样叶片中较低的CWIN活性导致SA和JA含量上升，从而提高了番茄叶片对Pst DC3000的抗性。其次，CWIN会对质外体空间的己糖含量产生影响。大量研究表明，病菌侵染植物后会诱导CWIN活性的上升，由于CWIN是在质外体空间将蔗糖水解为葡萄糖和果糖，因此病菌侵染诱导的CWIN活性上升往往会增加植物质外体空间的己糖含量，从而有利于病菌的生长[28]。我们的研究表明，接种Pst DC3000后，早、晚取样叶片的CWIN活性也受到诱导(图4-A)，但在接种0～48 h，晚上取样叶片的CWIN活性始终低于早上取样叶片，这可能会导致晚上取样叶片质外体空间的糖分含量低于早上取样叶片，从而抑制病菌的侵染。本研究只是测定了叶片中总的己糖含量，而没有区分细胞内和细胞外的己糖含量，因此，在将来的研究中应进一步测定接种后早、晚取样叶片在质外体空间(即细胞外)己糖含量上的差异。

此外，晚上取样叶片中较高的CIN活性可能通过增加番茄的抗氧化能力来提高其抗病能力。蔗糖分解产生的己糖(葡萄糖和果糖)可通过糖酵解和磷酸戊糖途径促进还原力(NADH和NADPH)和抗氧化物(如抗坏血酸和谷胱甘肽等)的合成，从而清除胁迫条件下产生的过量活性氧(如H2O2)并减少氧化胁迫所导致的细胞死亡现象[35]。虽然植物中存在4种蔗糖分解酶，但已有的研究表明，只有CIN介导的蔗糖分解与胁迫条件下植物的抗氧化能力密切相关。例如，在拟南芥原生质体中超表达CIN，可显著减轻外源H2O2处理所导致的氧化胁迫[36-37]。本研究表明，在3种转化酶中，只有CIN的活性表现为晚上取样叶片显著高于早上取样叶片(图4-B)，因此晚上取样叶片中更高的己糖含量应该来自于CIN介导的蔗糖分解(图3-A、B)。同时，晚上取样叶片中的细胞死亡现象和H2O2含量均显著低于早上取样叶片(图1-B、图5-A)。据此推测晚上取样叶片中较高的CIN活性可通过产生足够的己糖来提高叶片清除过量的活性氧(如H2O2)的能力，从而避免病菌侵染诱导的氧化胁迫所导致的细胞死亡，最终提高叶片的抗病能力。

最后，糖信号途径可能也参与番茄叶片的抗病反应。晚上取样叶片的己糖含量显著高于早上取样叶片，而蔗糖含量在早、晚取样叶片之间没有显著差异，这导致晚上取样叶片的己糖/蔗糖比值显著高于早上取样叶片。研究表明，增强的己糖信号(即高己糖/蔗糖比值)可以诱导植物的一系列防御反应如超敏反应(HR)、细胞壁加厚、抗病相关次生代谢物的合成(如phytoalexin)、昼夜节律以及气孔开度的变化等[28-29，38]。因此，晚上取样叶片中高的己糖/蔗糖比值可能会通过己糖信号诱导一系列植物抗病反应的发生，从而来增加番茄叶片的抗病能力。在下一步的研究中应加强己糖信号方面的研究。

总之，虽然晚上取样叶片的淀粉和己糖含量显著高于早上取样叶片，但晚上取样叶片对Pst DC3000的抗性强于早上取样叶片，表明叶片中的糖分特别是己糖并没有被病菌吸收利用，而是更多的被植物用于抗病反应，例如用于合成SA和JA以及清除过量的活性氧(H2O2)。此外，高的己糖含量也可能通过信号途径诱导植物的抗病反应。

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