绿豆晕疫病病原菌的分离和鉴定

田晓燕，孔庆全，贺小勇，赵存虎，陈文晋，马显民

（1.内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所，内蒙古呼和浩特010031；2.赤峰市翁牛特旗农牧局，内蒙古翁牛特旗024500）

绿豆是温带、亚热带和热带高海拔地区广泛种植的食用豆类作物[1]，产区主要在亚洲，被誉为“亚洲豆类作物”[2-3]。绿豆在我国已有2 000多年的栽培历史，我国绿豆年种植面积在80万hm2左右，总产量约100万t，是世界上最大的绿豆出口国[4-5]。内蒙古自治区是我国绿豆的主产区之一，播种面积每年平均保持在20万hm2以上，具有悠久的栽培历史和独特的地区优势，是一些冷凉山区、干旱与半干旱地区的主栽作物，也是当地农民主要的经济来源。

近年来随着绿豆产业的快速发展，出现了许多新的病虫害，特别是2009年我国东北地区的绿豆种植区首次发生绿豆晕疫病[6]，随后在全国绿豆主产区迅速传播和蔓延，造成严重的产量损失，成为我国绿豆生产的主要威胁。朱振东等[6]从2009年开始直至2014年，持续6年对覆盖我国7个地理区域的15个省（自治区）连续多年实地调查发现，绿豆晕疫病发生在我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、北京、河北、山西、陕西和新疆9个省和自治区的37个县（市），包括我国东北、北部和西北3个主要的绿豆产区。绿豆晕疫病造成绿豆平均减产30%～50%，产量损失超过80%，发病率最高为100%。该病曾造成陕西榆林市和河北宣化县绿豆绝收，已经威胁到我国绿豆生产体系[7]，因此，绿豆晕疫病的深入调查研究对于总结病害的流行规律和综合防控意义重大。

本研究在实地调查内蒙古自治区绿豆主产区晕疫病发生情况的基础上，通过病理学、生理生化及分子生物学方法对病原菌进行了分离与鉴定，旨在为绿豆晕疫病的防治奠定研究基础。

1 材料和方法

1.1 病害分布调查

由于新病害绿豆晕疫病的流行蔓延，对内蒙古绿豆产区造成了严重产量损失，本试验于2014—2018年连续5年实地调研内蒙古呼和浩特市、乌兰察布市、赤峰市、兴安盟等7个盟（市），包括托克托县、清水河县、凉城县、丰镇市、翁牛特旗、敖汉旗、突泉县和扎赉特旗等20多个县（市、旗）的绿豆晕疫病发生分布和危害程度情况，几乎涵盖了整个内蒙古绿豆产区。调研同时采集发病植株，并及时分离病原菌。

1.2 病样采集及病原菌分离

采集各地具有晕疫病典型症状的病叶或病荚，病叶症状为初期较下部叶片表面出现水渍斑，随后坏死，变为淡黄色到棕褐色，病斑周围产生一个宽的黄绿色晕圈，后期病斑在叶脉间扩展，连接成片，病斑变为黑色。

将采集到的病样，取病健交界部位切成小块，用75%的酒精表面消毒2～3 s，2%的次氯酸钠溶液消毒2 min，用无菌水冲洗3次后置于无菌研钵中同时加入600 μL无菌水研磨，取该组织液涂布在KB培养基（蛋白胨20.0 g，甘油10.0 g，K2HPO41.5 g，Mg2SO4·7H2O 1.5 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.2）平板，于28℃培养，48 h后挑取单个菌落进行划线纯化。

1.3 致病性测定

将健康绿豆种子，品种为冀绿7号，用0.3 %高锰酸钾溶液消毒20 min后，播种于盛有灭菌沙壤土的营养钵中，每盆3株，处理与对照各5盆。将分离所得菌株在KB培养基上28℃下培养48 h后，配成浓度为1×108CFU/mL的悬浮液。用喷雾法接种至生长14 d左右4～6叶期幼苗上，用手指将菌悬液轻轻涂抹均匀，将接种后的绿豆苗置于18～20℃气候室，套袋保湿48 h，以无菌水为对照。7 d后开始进行发病情况的观察，10～14 d后进行病原菌分离。

1.4 病原菌培养性状观察

供试菌株在KB平板上于28℃培养48 h后观察菌落形态、大小和颜色。

1.5 革兰氏反应

采用3 %的KOH反应测定，具体参照《常见细菌系统鉴定手册》[8]中的方法。

1.6 生理生化和碳源利用的测定

对供试菌株进行氧化酶测定，接触酶测定，葡萄糖、蔗糖、乳糖发酵试验，葡萄糖酸盐的氧化，淀粉水解试验，明胶水解试验，硝酸盐还原试验，硫化氢产生试验，脲酶测定，精氨酸双水解酶测定，生长温度等一系列生理生化指标测定和利用蔗糖、葡萄糖、肌醇、乳糖不同碳源的测定，具体参照《常见细菌系统鉴定手册》[8]和《植物病原细菌的分类和鉴定》[9]中的方法。

1.7 病原菌分子生物学鉴定

将供试菌株接种到KB液体培养基内，28℃振荡培养24 h，用天根细菌DNA试剂盒提取病原菌总基因组，然后用特异性引物[10]P1：5′-AGCTTCTCC TCAAAACACCTGC-3′，P2：5′-TGTTCGCCAGAGGC AGTCATG-3′进行PCR扩增，扩增产物为0.5 kb。引物序列交由大连宝生物工程有限公司合成。

PCR反应体系为：DNA模板50 ng，10 μmol/L引物P1、P2各1.0 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，2.5 mmol/L each dNTP 1.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，用ddH2O补足25 μL。

PCR反应条件：94℃预变性3 min后，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，循环38次，72℃延伸5 min。

用1 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。PCR产物委托英俊测序公司测序。序列递交GenBank数据库，使用Blastn程序进行相似性比较，从而确定供试菌株分类地位。

2 结果与分析

2.1 病害分布调查结果

2014年之前，晕疫病在内蒙古绿豆产区仅零星发生，并未大面积流行蔓延，2014年该病开始大面积流行蔓延，并造成严重产量损失。2014—2018年研究团队连续5年普查调研了内蒙古绿豆产区的7个盟（市）28个旗（县），发现几乎整个产区绿豆晕疫病均有发生，只是严重程度有所不同。干旱少雨的地方发生较轻，甚至不发生，冷凉、潮湿地区易发病且发病较重，呼和浩特市的托克托县、清水河县、赛罕区，乌兰察布市的凉城县、丰镇市、兴和县，赤峰市的松山区、翁牛特旗，兴安盟的乌兰浩特市、突泉县，呼伦贝尔市的扎兰屯发生危害较重。赤峰市和兴安盟平均发病率为20%～50%，其余地区平均发病率为50%～80%，个别发病较重地区发病率达100%。

2.2 病原菌分离及致病性测定结果

从以上各绿豆晕疫病发生地采集病样150余份，共分离获得50余份病原菌分离物，几乎每个发生旗县都分离到了菌株，在5个重发生盟市选取5个具有代表性的菌株继续进行试验。将分离得到的5个菌株接种绿豆幼苗，接种后的第6天植株叶背开始产生不规则的水渍状斑点，10 d之后扩展为深褐色的病斑，病斑周围有一圈宽的黄绿色晕圈，接种14 d左右植株系统褪绿、矮化，叶片向下卷曲，与田间症状一致（图1）。相反，接种无菌水的对照植株长势良好，健康无病。对发病植株进行再分离可以获得与接种病原菌相同的菌株，说明接种菌株为造成绿豆晕疫病的致病菌。

图1 绿豆晕疫病症状

2.3 病原菌形态特征观察

供试菌株在KB培养基上培养48 h后，菌落圆形、淡黄色，边缘整齐，典型特征是生长期间有浅黄绿色素产生并扩散到培养基中，366 nm紫外光下有黄绿色荧光。经电子显微镜观察，供试菌株均呈短杆状，2.2～5.5 μm，无芽孢，有极生鞭毛（图2）。

图2 病原菌菌落及其形态特征

2.4 革兰氏反应结果

供试菌株经3 %的KOH反应，能拉出丝状物，说明为革兰氏阴性菌。

2.5 生理生化和碳源利用结果

供试菌株氧化酶反应呈阴性，接触酶反应呈阳性，葡萄糖、蔗糖氧化性产酸，乳糖不产酸，葡萄糖酸盐的氧化、淀粉水解、精氨酸双水解酶反应均呈阴性，明胶水解、硝酸盐还原、硫化氢产生，脲酶测定均呈阳性，40℃和4℃下不能生长，最高生长温度为37℃，最低为5℃。蔗糖、葡萄糖、肌醇、乳糖供试菌株均能利用，利用程度为蔗糖＞肌醇＞葡萄糖＞乳糖。

2.6 病原菌分子生物学鉴定结果

供试菌株提取出DNA后用特异性引物P1、P2进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，从图3可以观察到，其片段大小为500 bp左右，与预期的目标条带大小相同，且完整性好、质量较高。

图3 部分供试菌株PCR扩增结果

PCR产物委托英俊测序公司测序，所测序列递交GenBank数据库，使用Blastn程序进行相似性比较，结果显示所测序列与丁香假单胞菌菜豆致病变种Pseudomonas syringae pv.phaseolicola的序列相似性高达99.99%，进一步确定了该致病菌株为丁香假单胞菌菜豆致病变种（图4）。

图4 分离菌株序列比对结果

3 讨论

近年来我国绿豆产业比重逐年加大，绿豆晕疫病也有明显的加重趋势。该病害是冷凉、潮湿地区常发生的病害，严重威胁绿豆的生产和品质[11]。到目前为止，只有少数几个国家报道了绿豆晕疫病，根据致病性测定结果，供试菌株接种绿豆后能引起与田间相同的症状，且与首次报道[12]的绿豆晕疫病的发病症状一致。据报道其病原菌为丁香假单胞菌菜豆致病变种（Pseudomonas syringae pv.phaseolicola）[13]，这与本研究结果一致。

国内对于小宗作物绿豆产业的病虫害研究少之又少，加之现如今的研究方向多以分子生物学为主导[14]，绿豆晕疫病菌的基础研究几乎没有，病原菌的生物学特性等研究在我国更是空白。本试验基于对病原菌的表型特征、生理生化特性、碳源利用的检测结果，除了生理生化特性中硝酸盐还原、脲酶测定和硫化氢产生结果与王淑秋等[15]报道的性状不一致，其余各性状均与王淑秋等[15]、GUVEN等[16]、JEON等[17]报道的性状一致。而该病原菌生理生化中3个测定指标不一致的原因可能是王淑秋等[15]的病原菌是从菜豆上分离获得，本试验的病原菌是从绿豆上分离得到的，同一菌种在不同的寄主上表现性状也可能会有差异。通过对病原菌基因组DNA进行特异性引物PCR扩增，得到了与Pseudomonas syringae pv.phaseolicola预期大小相同的目标条带，检测结果同王淑秋等[15]报道一致，且其基因序列与Pseudomonas syringae pv.phaseolicola的序列相似性高达99.99%。

目前，国内对于绿豆新病害晕疫病的研究未见报道，本试验通过对绿豆晕疫病菌培养性状、生理生化特性和碳源利用等方面的研究，增添了对绿豆晕疫病的新认知，也为绿豆生产中病虫害防治提供了理论基础。