重组人脂联素对SD大鼠胫骨骨折愈合过程的影响

王 洋，王良宸，万丽娟，张宇轩，廖思达，孟昊业，李春霖，龚燕平

1 解放军总医院第二医学中心 国家老年疾病临床医学研究中心，北京 100853；2 解放军总医院 骨科再生医学北京市重点实验室 全军骨科战创伤重点实验室，北京 100853

骨折是骨科临床最常见问题之一，其中四肢骨折最为常见。长骨骨折通常是由于运动训练、高空坠落和交通事故等剧烈撞击导致，其中股骨干骨折、肱骨骨折和胫骨骨折分别占成人骨折的3%、14%和24%[1]。汶川地震德阳医院共收治地震致骨折患者596例，其中上肢骨折132例(22.1%)，下肢骨折496例(83.2%)。部分骨折患者出现的骨不连和骨折愈合延迟仍是当今临床上的巨大挑战[2]。目前常用的治疗方法有自体骨移植物治疗和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)治疗，BMP存在来源难寻、成本高和不良反应重等相关问题，导致了治疗效果有限。脂联素(adiponectin，APN)最初被认为是一种脂肪源性激素[3]。后来发现骨骼肌、骨细胞和淋巴细胞也能产生脂联素。但脂肪组织仍然是血清脂联素的主要产生者，脂联素在血清中约占血清蛋白质的0.01%(5～10mg/L)[4]；其具有多种生物学功能，如提高胰岛素敏感度，降低高血压风险，抑制动脉粥样硬化、肝纤维化和肿瘤生长等[5]。近年来有研究表明骨骼与脂肪有着密切联系[6-7]，脂联素作为脂肪因子，具有加速成骨、抑制破骨的作用[8]。因此，我们用局部注射重组脂联素的方法治疗SD大鼠胫骨闭合性骨折，观察脂联素对大鼠骨折愈合过程中骨痂形成、成骨因子表达和骨微结构重建的影响。

材料与方法

1实验动物 Sprague Dawley(SD)雄性大鼠18只，体质量约200 g，二级实验动物，由斯贝福(北京)生物科技有限公司提供，动物合格证编号：SCXK (京)2016-0002。饲养于光照充足，通风良好的环境，室温20℃～25℃，适应性饲养1周后进行试验。

2脂联素合成 在NCBI搜索人脂联素蛋白的氨基酸序列，在C端融合IgG-Fc片段，经密码子优化后得到cDNA序列。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR) 扩增cDNA序列，产物经凝胶电泳后，割胶回收。ADPN片段与经Bglll和BamHl(苏州思坦维公司1021A，1010S)消化后的Fc-GS质粒融合，转化入大肠埃希菌培养过夜。离心柱式提取试剂盒提取扩增质粒。质粒用HindⅢ/XhoⅠ限制性内切酶(A001303，B600236，上海)消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳并测序。电穿孔转染法转染CHO-K1细胞(Invitrogen公司)。蛋氨酸亚氨基代砜 (Methionine sulfoximine,MSX，SIGMA，M5379) 筛选和Protein A层析柱纯化。

3动物胫骨闭合性骨折模型制作 大鼠禁食12 h后，水合氯醛腹腔注射麻醉，皮肤消毒，将右后肢固定于骨折造模器铁砧上，暴力撞击胫骨中下1/3处的前方造成闭合性骨折。从胫骨粗隆下0.5cm处穿入7号针头进行髓内固定，穿入深度到底后剪除针头外露部分。术后腹腔注射100000U青霉素预防感染。

4分组及处理 将大鼠随机分为空白对照组(0.9%氯化钠注射液)，脂联素治疗1组 (APN剂量1mg/kg)，脂联素治疗 2 组(APN剂量2mg/kg)，正常对照为对侧胫骨，每组6只。各组均在造模后立即骨折处局部注射0.5mL药物1次。

5标本采集 大鼠骨折造模6周后，处死大鼠取出双侧胫骨，用4%多聚甲醛固定48 h，10%EDTA脱钙4周，隔日换液。将部分标本经自动脱水机脱水(Leica，ASP200S)，石蜡包埋机包埋(Histecore，Areadia H)。

6HE染色和Masson染色 石蜡切片，厚度为5µm，进行常规HE染色，观察骨折部位骨小梁、板层骨重建等情况。组织石蜡切片常规脱蜡至水，苏木精染色10min，分化液分化30 s，自来水浸泡15min，伊红染色液1min，自来水冲洗、浸泡5min，常规脱水透明封片，观察骨折处骨小梁、板层骨情况。Masson染色按试剂盒说明书进行(索莱宝，G1340)，观察骨折处胶原蛋白表达情况。

7免疫荧光染色 部分标本经30%蔗糖脱水后，冷冻切片，厚度7µm，进行免疫荧光染色，观察骨钙素骨钙素(osteocalcin，OCN)(Abclonal，A6205)，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)(Abcam，ab95462)表达情况。标本经PBS洗3次后用3%过氧化氢进行过氧化物酶灭活，羊血清封闭后，加一抗4℃冰箱过夜，加荧光二抗，室温孵育1 h后加DABI，水性封片后在荧光显微镜(Olympus，BX51TR)下观察，随机选取5个高倍镜视野观察拍照，并用ImageJ 1.51分析图像的荧光表达强度及面积。

8micro-CT分析 micro-CT(P2000RS，GE healthcare，USA；System：RS-9)参数设置为45 µm-ss，80 kV，450 µA，Air 0.25，Water 13.84，Bone：3421。兴趣区(ROI)设定为骨折线上下各0.5mm。通过机器配套软件microView 2.1计算分析得到骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁空间(Tb.Sp)。

9统计学分析 使用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行统计分析。观测资料均为计量数据，以表示，采用单因素方差分析+两两比较LSD检验分析各组差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1骨折6周后各组愈合情况大体观 骨折造模后6周时处死大鼠取出双侧胫骨，脂联素治疗组骨折线几乎消失，骨折基本愈合完毕，空白组还留有较明显的骨折线。见图1。

图1 造模6周后各组大鼠胫骨愈合情况大体观(右侧标本为正常对照，左侧为骨折模型组，黄色圆圈部分是骨折断端)Fig.1 general view of tibial healing after 6 weeks of fracture (In each figure, the right tibia is the normal control, the left is the fractured tibia. The yellow circle indicates the broken end of the fracture)

2骨折处骨痂HE染色结果 显微镜下观察发现，与对照组相比，脂联素治疗组内骨痂、外骨痂厚度高于对照组，骨小梁增多明显，板层骨厚度形成明显优于对照组，骨痂改建好。见图2。

图2 骨折处骨痂HE染色图 （红染部分为骨质，骨小梁穿插其间)Fig.2 Results of HE staining of bone callus (The red stained part is bone, with trabeculae interspersed)

3骨折处骨痂Masson三色染色结果 成熟骨组织中胶原着红色，骨痂愈合过程中随着骨成熟度升高，红染越来越多，与对照组相比，治疗组红染更多，提示胶原合成更多，骨骼成熟度更高。见图3。

图3 骨折处骨痂Masson染色图(红染部分为胶原染色，蓝染部分为矿化骨)Fig.3 Results of Masson staining of bone callus (The red stained part is collagen, and the blue stained part is mineralized bone)

4骨折处骨痂免疫荧光观测结果 成骨细胞聚集的骨膜和骨陷窝处，高倍镜视野下1mg/kg治疗组促成骨相关因子OCN、ALP表达量分别为0.61%±0.21%、0.86%±0.63%，2mg/kg治疗组为0.44%±0.17%、0.70%±0.34%，均优于对照组的0.27%±0.17%、0.35%±0.15%(P< 0.05)。见图4。

图4 骨折处骨痂免疫荧光染色图(白色箭头所指为骨膜，黄色箭头所指为骨陷窝)Fig.4 Results of immunofluorescence staining of callus (The white arrow indicates periosteum and the yellow arrow indicates lacunae)

5骨痂处骨微结构 micro-CT分析显示，对照组、1mg/kg治疗组和2mg/kg组，BV/TV分别为26.37%±4.32%、53.76%±7.89%和45.10%±5.45%，Tb.Th分别为(269.6±36.80) µm、(363.9±51.45) µm、(296.5±24.33) µm，Tb.N分别为(10.51±1.49)/cm、(15.68±2.11)/cm、(14.4±1.83)/cm，Tb.Sp分别为(604.3±78.27) µm、(344.6±98.79) µm、(436.1±63.75) µm。脂联素1mg/kg治疗组骨痂处BV/TV和Tb.Sp均优于对照组(P＜0.05)，脂联素 2mg/kg治疗组BV/TV、Tb.N和Tb.Sp优于对照组(P＜0.05)，但Tb.Th与对照组比较，差异无统计学意义。见图5。

图5 micro-CT检测骨折处骨痂微结构(aP < 0.05，bP < 0.01)Fig.5 micro-CT results of bone callus (aP < 0.05, bP < 0.01)

讨 论

既往有研究表明，脂联素可以逆转OVX诱导的肌萎缩、身体成分和能量代谢的变化，被认为是调节骨骼稳态的重要因素[9-12]。Kajimura等[13]发现脂联素根据动物年龄的大小具有不同的骨骼效应，其会抑制幼鼠的骨量增加，但可以促进成熟小鼠的骨量增加。因此脂联素对于骨骼的作用尚未明确，是否能促进大鼠闭合型骨折愈合未有研究。我们的研究证实脂联素可以促进大鼠的骨折愈合。

骨折时，破骨细胞和成骨细胞的协调作用，使骨折处的骨痂经骨吸收、骨重塑等过程逐渐变为正常骨骼。骨折愈合在时间上可分为炎症期、软骨痂期、硬骨痂期和骨重塑期，这些阶段有一些重叠[14-15]。既往有研究表明脂联素可以保护软骨细胞[16]，并可以促进软骨细胞的增殖分化[17]。骨折愈合程序可以由损伤触发，局部组织出现血肿和炎症，加速骨髓间充质细胞在骨损伤处的募集，细胞的趋化作用和募集有利于血肿炎症期后的成软骨细胞分化和成骨细胞分化。脂联素可以使骨髓腔中的CXCL12表达降低，但其在外周血中水平上会升高，这会诱导骨髓间充质细胞从骨髓迁移到外周循环，并重新募集到骨折部位，为骨折部位的骨小梁生成和骨骼重塑提供细胞基础[18-19]。本研究通过HE染色发现，治疗组骨痂重建更好，骨痂更厚。Masson染色结果显示，应用脂联素后，骨痂成熟度更高。micro-CT结果也提示治疗组骨痂的微结构Tb.Th、Tb.N及Tb.Sp均优于对照组。

BMP信号通路被认为是调节骨和软骨发育、再生的重要途径，在骨细胞分化和成熟过程中起重要作用[20]。其与有丝氨酸苏氨酸激酶活性的特定细胞表面受体结合特异性地转导BMP信号，诱导受体调节的Smads(Smad1、5、8)磷酸化以激发其功能，并在骨细胞中大量表达OCN、ALP以促进成骨[21]。在小鼠间充质干细胞分化实验中，BMP-2的mRNA水平在骨折后24 h内即可达到高峰，并且BMP-2可以调控骨形态发生蛋白家族中其他几种类型蛋白的表达，是骨髓间充质干细胞能否成功分化为成骨细胞的关键[22]。Kloen首次报道接受外科手术骨折患者骨痂中BMP的表达情况，免疫组化结果显示，在软骨内骨化区的BMP-2和BMP-4表达增加，而且在新形成的类骨质中表达更高。BMP-3和BMP-7只在类骨质中大量表达。OCN可以由脂肪、肌肉、睾丸等多器官分泌，是骨形成的决定因素[23]。OCN作为一种最丰富的成骨细胞特异性非胶原蛋白，最初是一种前体激素Pro-OCN，分泌前会在维生素K的辅助下，在成骨细胞的内质网中羧基化，增强其对Ca2+和羟基磷灰石的亲和力，转变为有功能的细胞因子。OCN与骨发育、骨代谢关系密切，可以促进新骨形成和骨损伤的修复[24-25]。ALP在骨骼成熟及骨骼矿化的过程中有着重要的作用。在体内ALP可以促进羟基磷灰石在细胞内的转运，同时还能有效促进骨细胞中钙的沉积，从而加强成骨和骨骼重塑的作用。我们通过免疫荧光染色发现治疗组的骨痂OCN、ALP表达升高。因此我们推测在大鼠骨折愈合过程中脂联素可能是通过BMP/Runx2信号通路发挥作用，促进骨折愈合过程中成骨因子表达以加速愈合。

综上所述，脂联素在促进SD大鼠骨折愈合过程中发挥了积极作用，其可能通过促进成骨因子表达促进骨折愈合。