肥胖对雄性小鼠生殖系统的损伤及表观遗传机制研究

王翠艳，杜学孟，刘红英，董晓云（通讯作者）

（潍坊医学院 山东 潍坊 261053）

近年来研究表明，肥胖可影响精子的正常发育与成熟过程[1]，对精子质量有着至关重要的影响[2]，但具体机制尚不明确。表观遗传改变在精子发育过程中的作用受到了越来越多的关注，如精子残余组蛋白是否被正确修饰是精子正常发育和成熟的关键环节[3]。本实验旨在研究肥胖对雄性小鼠生殖系统的损伤及对残余组蛋白H3乙酰化修饰的影响，以期从表观遗传学角度为男性不育的临床治疗提供新策略。

1.材料与方法

1.1 实验动物及分组建模

选取2019年10月—2020年6月健康SPF级C57BL/6雄鼠20只，周龄5周，初始体重19～20 g，随机分为肥胖组和对照组。肥胖组选用高脂饲料配方喂养，对照组选用标准饲料喂养，建模期间，两组小鼠饮水光照等条件相同。

1.2 指标检测

1.2.1 标本采集 定时监测小鼠体重，建模成功后，称量腹部脂肪，做血脂分析，取附睾做精子形态观察，以及精子密度、活力参数、动力参数检测分析，并提取组织蛋白，做Western Blot免疫印迹实验。

1.2.2 血脂检测 用注射器抽取小鼠心脏血液约1 mL置于1.5 mL Ep管中，5 000 rpm，5 min离心取血清，使用全自动生化分析仪做血清甘油三酯和总胆固醇检测。

1.2.3 精子指标分析 用伟力图像分析系统进行精子形态、密度、活力、畸形率等参数的检测。

1.2.4 组织蛋白提取及Western Blot免疫印迹 配制SDS-PAGE凝胶，加样、转膜、封闭后，加一抗过夜，加二抗孵育2 h，ECL显影检测。

1.3 统计学分析

应用SPSS 26.0统计软件进行数据处理分析，计量资料以（±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1小鼠建模结果 肥胖组小鼠体重、腹部脂肪重量、血清甘油三酯、血清总胆固醇均高于对照组20%以上（图1、图2），差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 两组血清甘油三酯、血清总胆固醇对比

图2 两组小鼠体重、腹部脂肪对比

2.2 小鼠精子指标分析结果

2.2.1 精子形态分析 与对照组相比，肥胖组小鼠精子正常精子形态率显著降低，镜下可见畸形精子，见表1、图3。

表1 两组小鼠精子形态率比较（±s）

表1 两组小鼠精子形态率比较（±s）

分组 n 正常精子形态率/% P肥胖组 10 61.32±2.46 0.013对照组 10 83.37±2.87

图3 精子形态分析

2.2.2 精子密度、活动参数分析比较 肥胖组小鼠精子密度、精子活动力均显著低于对照组（P＜0.05），见表2、图4。

表2 两组小鼠精子密度、活动参数分析比较（±s）

表2 两组小鼠精子密度、活动参数分析比较（±s）

分组 精子密度/（106·mL-1） 精子活动率/% A级精子/%肥胖组 57.11±5.20 23.17±3.70 3.08±0.29对照组 100.30±15.01 45.67±5.49 8.37±1.06 P 0.027 0.023 0.016分组 B级精子/% C级精子/% D级精子/%肥胖组 6.51±1.58 10.49±2.27 76.82±3.70对照组 14.16±1.30 24.79±5.70 54.33±5.49 P 0.042 0.040 0.023

图4 小鼠精子密度、活动参数分析比较

2.2.3 精子动力参数分析比较 对比两组小鼠精子的动力参数发现，除MAD、BCF、WOB（P＞0.05）之外，其余参数均有显著差异（P＜0.05），见表3、图5。

图5 小鼠精子动力参数分析比较

表3 两组小鼠精子动力参数分析比较（±s）

表3 两组小鼠精子动力参数分析比较（±s）

动力参数 肥胖组 对照组 P曲线速度VCL/（um·s-1） 35.10±1.31 42.14±1.28 0.002直线速度VSL/（um·s-1） 15.40±0.94 20.28±1.60 0.045平均路径速度VAP/（um·s-1） 19.97±1.07 25.16±1.27 0.033平均移动角度MAD/° 76.68±0.51 72.65±5.38 0.460侧摆幅度ALH/μm 2.10±0.09 3.27±0.36 0.025鞭打频率BCF/Hz 7.86±0.41 6.99±0.61 0.317直线性LIN/% 39.68±0.86 49.46±3.98 0.048摆动性WOB/% 53.78±1.67 59.39±3.97 0.190前向性STR/% 70.32±1.23 80.19±1.75 0.016

2.3小鼠精子组蛋白H3K56乙酰化水平检测分析结果

肥胖组小鼠精子残余组蛋白H3K56乙酰化程度显著低于对照组（P=0.0063＜0.01），见表4、图6。

表4 两组小鼠AcH3K56乙酰化蛋白免疫印迹灰度值对比分析

图6 Graghpad软件对免疫印迹条带灰度分析

3.讨论

最新统计数据表明，目前世界范围内约7%的男性受到不育的困扰[4]。其中，遗传因素占10%～15%[5]。除遗传因素外，环境因素对男性生殖健康的影响同样至关重要，如内分泌紊乱、肥胖、激素疾病、睾丸损伤、泌尿生殖系统感染等[6]。

早在2006年，研究者就已发现肥胖与男性不育呈负相关[7]。近年来，在临床就诊的男性不育症患者中，肥胖患者呈持续增加趋势[8]。关于肥胖对精子指标的影响众说纷纭，本次结果显示，肥胖小鼠精子形态出现明显异常，且精子密度、活动参数均显著低于对照组（P＜0.05），动力参数结果不一致，其中精子曲线速度、直线速度、平均路径速度、侧摆幅度、直线性百分率、前向性百分率两组比较均有显著差异（P＜0.05），而精子平均移动角度，鞭打频率与摆动性百分率两组之间无显著差异（P＞0.05）。

既往研究表明，肥胖可通过影响下丘脑垂体性腺轴直接影响男性生殖健康[9]，可以通过增高代谢率，增加活性氧形成，影响精子正常生理功能。除上述机制外，近年来发现肥胖可引起精子表观遗传修饰异常，进而影响其正常功能。参与这一过程的遗传机制主要包括DNA甲基化、残余组蛋白修饰及精子小RNA变化等[10]。其中残余组蛋白的不同表观修饰方式对精子正常生长发育起着重要的调控作用，它们的相互协调可以保证精子表型的正常表达。本实验结果显示，肥胖组小鼠精子残余组蛋白AcH3K56乙酰化程度显著低于对照组，差异显著（P＜0.01）。

综上所述，肥胖可以影响精子正常功能与形态，同时降低残余组蛋白H3乙酰化修饰程度。这一发现将会为临床男性不育症患者的治疗提供新的策略和方向。