白细胞介素-37在结肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞增殖、侵袭的作用*

刘月红，赵家宁，王科，任博，王文帅

（西安市第四医院1.临床检验中心，2.输血科，陕西西安710004；3.重庆市永川区人民医院检验科，陕西西安412060；4.沣东新城公共卫生管理中心，陕西西安710086）

结肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率及病死率呈逐年升高趋势[1-2]。手术切除、辅助化疗、靶向治疗是临床治疗结肠癌的主要手段，但治疗过程中的复发率、转移率较高，整体预后并不理想。癌细胞过度增殖及侵袭是与结肠癌复发、转移直接相关的恶性生物学行为，针对癌细胞的增殖、侵袭进行干预也是结肠癌新治疗手段的靶点。

白细胞介素-37（Interleukin-37,IL-37）是近年来新发现的白细胞介素-1 家族的抑炎细胞因子，在固有免疫应答及适应性免疫应答中均发挥重要作用[3]。近年来，炎症微环境与恶性肿瘤发生的关系受到了越来越多的关注[4-5]，具有抑炎作用的IL-37也被证实能够在宫颈癌、膀胱癌、肺癌等恶性肿瘤中发挥抑癌作用[6-8]。但IL-37 是否参与结肠癌细胞恶性生物学行为的调控仍未明确。为探讨IL-37在结肠癌发生、发展中的作用，探究未来使用IL-37治疗结肠癌的可能性，本研究检测IL-37 在结肠癌组织中表达的变化，并通过体外实验探讨其对结肠癌细胞增殖、侵袭的作用。

1 材料与方法

1.1 临床标本

收集2017年4月—2019年4月在西安市第四医院手术切除的结肠癌组织及其癌旁组织，共42 例。均取得患者的知情同意及医院伦理委员会的批准。

1.2 细胞

结肠癌HT29 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，液氮中冷冻保存。

1.3 试剂与仪器

空白pcDNA3.1 质粒、表达IL-37 的pcDNA3.1 重组质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合

成，质粒浓度2.0 mg/ml；转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen 公司，MTS 细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega 公司，IL-37、信号转导及转录活化因子3（STAT3）、磷酸化信号转导及转录活化因子3（p-STAT3）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的单克隆一抗购自英国Abcam公司，DP430总RNA 提取试剂盒、KR118 cDNA 第一链合成预混试剂盒、FP209 Talent 荧光定量检测试剂盒（SYBR Green）购自北京天根公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及分组HT29 细胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640 在培养瓶中贴壁培养，0.25%胰蛋白酶常规消化并传代继续培养。取传代后对数生长期的细胞，分为对照组、空白质粒组、IL-37 质粒组。对照组用不含转染试剂、质粒的RPMI 1640 处理；空白质粒组用LipofectamineTM2000 转染空白pcDNA3.1 质粒，质粒终浓度为1.0 μg/ml；IL-37质粒组用LipofectamineTM2000 转染表达IL-37 的pcDNA3.1重组质粒，质粒终浓度为1.0 μg/ml。每个处理条件设置6 个复孔，连续处理24 h。

1.4.2 MTS 检测细胞增殖能力传代细胞接种于96 孔板中，分组处理24 h 后，采用MTS 细胞增殖检测试剂盒检测细胞的增殖能力，按照试剂盒说明书进行操作，染色后在酶标仪490 nm 波长处检测光密度（OD）值，OD 值越高表示细胞增殖能力越强。

1.4.3 Transwell 实验检测细胞侵袭活力在Transwell 的上室预涂基质胶，而后传代细胞接种在Transwell 的上室并分组处理；向下室加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640，趋化上室内的细胞进行侵袭。24 h 后，取下小室膜，结晶紫染色后在显微镜下观察，随机取5 个视野进行细胞计数。

1.4.4 Western blotting 检测IL-37、p-STAT3、p-Akt蛋白表达取结肠癌组织、癌旁组织和分组处理后的HT29 细胞，采用RIPA 裂解液提取组织及细胞中的蛋白，测定蛋白含量后取30 μg 蛋白进行Western blotting 检测。将蛋白样本加入聚丙烯酰胺凝胶中电泳，而后电转移至NC膜，用5%脱脂牛奶封闭NC膜2 h，用1∶1 000 稀释的IL-37、STAT3、p-STAT3、Akt、p-Akt 一抗4℃孵育过夜；次日，用1∶1 000 稀释的HPR 二抗孵育NC 膜1 h，显影后得到蛋白条带，根据条带灰度值计算IL-37、p-STAT3、p-Akt 蛋白相对表达量，β-actin为阴性对照。

1.4.5 qRT-PCR 检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）mRNA 相对表达量取分组处理后的HT29 细胞，采用总RNA提取试剂盒分离细胞中的RNA，采用cDNA 第一链合成预混试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，最后采用Talent 荧光定量检测试剂盒配置PCR 体系对cDNA进行扩增，反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性15 s、60℃退火25 s，重复40 个循环。β-actin 为阴性对照。Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 正反向引物序列见表1。自动生成循环阈值（Ct），2-△△Ct法计算Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA 相对表达量。

表1 引物序列

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织与癌旁组织中IL-37 蛋白相对表达量的比较

结肠癌组织和癌旁组织中IL-37 蛋白相对表达量为（0.31±0.07）和（0.92±0.16）。两者比较，经t检验，差异有统计学意义（t=19.393，P=0.000），结肠癌组织中IL-37 蛋白相对表达量降低。见图1。

图1 结肠癌组织与癌旁组织中IL-37蛋白相对表达量

2.2 3 组结肠癌HT29 细胞中IL-37 蛋白相对表达量的比较

结肠癌HT29 细胞中，对照组、空白质粒组和IL-37 质粒组的IL-37 蛋白相对表达量分别为（0.20±0.06）、（0.22±0.08）和（0.98±0.21），3 组比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=11.384，P=0.000）；进一步两两比较，IL-37 质粒组IL-37 的蛋白相对表达量高于对照组及空白质粒组（P＜0.05）。见图2。

图2 3组HT29细胞中IL-37蛋白相对表达量

2.2 3 组结肠癌HT29 细胞的OD 值和穿膜细胞数比较

3 组结肠癌HT29 细胞的OD 值和穿膜细胞数比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较，IL-37 质粒组的OD 值、穿膜细胞数较对照组及空白质粒组降低。见图3 和表1。

图3 3组结肠癌HT29细胞侵袭能力比较 （结晶紫染色×400）

表1 3组HT29细胞的OD值和穿膜细胞数的比较（x±s）

2.3 3 组结肠癌HT29 细胞的Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达量比较

3 组结肠癌HT29 细胞的Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较，IL-37 质粒组CyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA 相对表达量较对照组及空白质粒组降低（P＜0.05）。见表2。

表2 3组结肠癌HT29细胞的Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达量的比较 （±s）

表2 3组结肠癌HT29细胞的Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达量的比较 （±s）

组别Cyclin D1 mRNA Bcl-2 mRNA MMP-2 mRNA MMP-9 mRNA对照组空白质粒组IL-37质粒组F 值P 值0.88±0.15 0.93±0.17 0.40±0.08 126.060 0.000 0.79±0.14 0.84±0.18 0.50±0.09 93.394 0.000 0.91±0.16 0.98±0.17 0.33±0.08 137.658 0.000 0.71±0.15 0.77±0.20 0.45±0.08 67.348 0.000

2.4 3 组结肠癌HT29 细胞中p-STAT3、p-Akt 蛋白相对表达量的比较

3 组结肠癌HT29 细胞中p-STAT3、p-Akt 蛋白相对表达量的比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），进一步两两比较，IL-37 质粒组较对照组及空白质粒组p-STAT3、p-Akt 的蛋白相对表达量降低（P＜0.05）。见表3 和图4。

表3 3组结肠癌HT29细胞中p-STAT3、p-Akt蛋白相对表达量的比较 （±s）

表3 3组结肠癌HT29细胞中p-STAT3、p-Akt蛋白相对表达量的比较 （±s）

组别p-STAT3 p-Akt空白对照组空白质粒组IL-37质粒组F 值P 值0.92±0.15 0.98±0.17 0.42±0.09 135.021 0.000 0.96±0.18 0.91±0.14 0.40±0.10 126.300 0.000

图4 3组结肠癌HT29细胞中p-STAT3、p-Akt蛋白的表达

3 讨论

结肠癌的发生涉及多因素、多环节，其中炎症微环境与结肠癌发生的关系近年来受到越来越多的关注[9]。在肿瘤的炎症微环境中，多种促炎因子、趋化因子、血管新生因子表达增多，进而促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及肿瘤新生血管的形成[10-12]。IL-37是新型的抑炎细胞因子，对多种促炎因子、趋化因子的生成具有抑制作用。已有报道，结肠癌IL-37低表达患者的无进展生存期较IL-37 高表达患者明显缩短[13-14]。本研究所检测的结肠癌组织及癌旁组织中，结肠癌组织中IL-37 蛋白相对表达量低于癌旁组织。以上结果提示IL-37 表达减少与结肠癌的发生、发展及预后转归均密切相关，IL-37可能具有抑癌作用，本研究进一步通过体外细胞实验来验证IL-37的抑癌作用。

有研究报道，IL-37 对宫颈癌、膀胱癌、肺癌等恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭具有抑制作用[6-8]。本研究在体外实验中观察IL-37 对结肠癌细胞增殖、侵袭的抑制作用。已培养的结肠癌HT29 细胞用LipofectamineTM2000 转染表达IL-37 的pcDNA3.1 重组质粒，可以观察到结肠癌HT29 细胞中IL-37 蛋白相对表达量增多，说明转染表达IL-37 的重组质粒能够引起结肠癌HT29 细胞中IL-37 的过表达。在过表达IL-37 后分别通过MTS 细胞增殖试剂盒和Transwell 实验检测细胞增殖及侵袭可知，细胞的OD 值及侵袭能力均降低，说明过表达IL-37 能够显著抑制结肠癌HT29 细胞的增殖和侵袭，与既往关于IL-37 在其他恶性肿瘤中的抑癌作用吻合[15-16]。

在结肠癌发生发展过程中，结肠癌细胞的增殖和侵袭受到相应基因的调控，Cyclin D1和Bcl-2是促进细胞增殖的基因，MMP-2和MMP-9是促进细胞侵袭的基因。已有研究报道，结肠癌组织中上述增殖和侵袭基因的表达均明显增多[17-20]。Cyclin D1能够使细胞周期加速并促进细胞有丝分裂，Bcl-2能够拮抗线粒体途径凋亡并促进细胞异常增殖，MMP-2和MMP-9能够水解细胞外基质及基底膜并促进细胞向邻近组织侵袭[21]。在本研究中，转染质粒过表达IL-37 后，结肠癌HT29 细胞中Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2 和MMP-9 mRNA 相对表达量均降低，说明IL-37 对结肠癌细胞中促增殖及促侵袭基因的表达具有抑制作用，这与IL-37 抑制结肠癌细胞增殖、侵袭的作用吻合。

在明确IL-37 能够抑制结肠癌细胞增殖、侵袭并调节相应基因的表达后，本研究还对IL-37 发挥上述作用的分子机制进行了初步的探索。宫颈癌、肺癌的相关研究证实，IL-37 能够通过抑制STAT3的激活来发挥抑癌作用[8，21]；肝癌的相关研究证实，IL-37 能够通过抑制Akt 的激活来发挥抑癌作用[22]。在结肠癌中，STAT3 和Akt 的表达均明显增多[23-24]，且阻断STAT3/Akt 通路能够抑制离体培养结肠癌细胞的增殖，增强顺铂化疗的敏感性[25]。本研究在转染质粒过表达IL-37 后，IL-37 质粒组细胞中的p-STAT3、p-Akt 蛋白相对表达量降低，说明IL-37 对结肠癌细胞中STAT3/AKT 通路的激活具有抑制作用，这也可能是IL-37 在结肠癌中发挥抑癌作用的分子机制。

综上所述，IL-37 在结肠癌组织中表达减少；在体外实验中，增加IL-37 的表达能够抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭，且该抑制作用可能与抑制STAT3/Akt 通路有关，今后IL-37 有望成为治疗结肠癌的新靶点，但本研究未能得到IL-37 直接通过STAT3/Akt 通路抑制结肠癌细胞增殖、侵袭的证据。今后应进一步使用STAT3/Akt 通路抑制剂或设计STAT3、Akt 的siRNA，在过表达IL-37 的同时联用STAT3/Akt 通路抑制剂或siRNA，以此来验证IL-37通过STAT3/Akt 通路抑制结肠癌细胞增殖、侵袭的作用。