结直肠癌患者血清microRNA-335、microRNA-497表达与临床病理特征及预后的关系*

聂向荣，武剑磊，武永庆

[邯郸市中心医院1.普外三科，2.邯郸市中心医院急诊外科，河北邯郸056001；3.武安市第一人民医院骨科，河北武安056399]

2018年国际结直肠癌新发病例约为110万人，占恶性肿瘤新发病例的6.1%，而死亡人数约为55 万人，占恶性肿瘤死亡人数的5.8%，发生率和病死率分别排在恶性肿瘤的第4 位和第5 位，对人们的生命健康造成严重威胁[1]。目前对结直肠癌的发病过程仍然缺乏了解，已有研究报道在结直肠癌发生、发展过程中大量microRNA（miRNA）的表达存在异常[2]。miRNA 是一类长度在20～25 nt 的单链RNA 分子，不编码多肽和蛋白质，但是在细胞分裂、分化、细胞代谢、细胞物质运输等过程中均起到一定的调节作用[3]。其中microRNA-335（miR-335）与肿瘤的发生、发展密切相关，是一种抑癌基因，在肝癌和肺癌中低表达，并且能够抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移[4]。microRNA-497（miR-497）同样是一种抑癌基因，在肝癌和喉鳞状细胞癌中低表达，并且miR-497低表达与肿瘤患者的不良预后密切相关[5-6]。本研究通过检测血清miR-335、miR-497 表达水平，探讨其表达水平与结直肠癌患者临床病理特征和预后的关系。现报道结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年2月—2014年9月于邯郸市中心医院诊治的结直肠癌患者99 例作为结直肠癌组。其中，男性59 例，女性40 例；年龄42～75 岁，平均（58.67±13.96）岁；肿瘤直径＜5 cm 的52 例，肿瘤直径≥5 cm 的47 例。32 例肿瘤位于左半结肠，31 例位于右半结肠，36 例位于直肠。浸润深度T1患者11 例，T2患者16 例，T3患者39 例，T4患者33 例。TNM 分期Ⅰ期患者41 例，Ⅱ期患者27 例，Ⅲ期患者31 例。肿瘤低分化患者17 例，肿瘤中分化患者51例，肿瘤高分化患者31例。有脉管浸润25例，有神经浸润9例。淋巴结转移患者37 例，无淋巴结转移患者62 例。选择同期在该院体检的99 例健康者作为健康组。其中，男性53例，女性46例。年龄40～71岁，平均（54.96±12.87）岁。纳入标准：①患者经病理学诊断确诊为结直肠癌；②入院前6 个月内无抗炎药物治疗史；③无放化疗治疗史；④患者适宜进行手术治疗。排除标准：①合并其他肿瘤；②存在全身性感染性疾病、系统性疾病和自身免疫性疾病；③临床病理资料不完整；④入院前3 个月内有外科手术史。两组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有研究对象签署同意书。

1.2 实验试剂及仪器

miRNA 分离试剂盒（商品编号：QA1290）、cDNA合成试剂盒（商品编号：QA2317）、mirVana™qRTPCR miRNA 检测试剂盒（商品编号：QA1541）均购自德国Qiagen 有限公司，引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。台式高速离心机（型号：5810）购自美国Eppendorf 科学仪器有限公司，荧光定量PCR 仪（型号：VIIA7）购自美国ABI 科技有限公司。

1.3 血清miR-335、miR-497表达水平检测

1.3.1 血清总RNA提取采集入组人员空腹静脉血5 ml（健康组体检时及结直肠癌组入院后），室温3 000 r/min 离心20 min，半径10 cm，取上清液于另一干净离心管中，置入-80℃冰箱冷冻保存。采用miRNA 分离试剂盒对血清中的总RNA 进行提取，实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 miRNA 逆转录使用cDNA 合成试剂盒对miRNA 进行逆转录，逆转录体系总体积为20 μl，包括：总RNA 1 μl，miRNA-Script-缓冲液4 μl，逆转录引物Mix 2 μl，蒸馏水13 μl。逆转录条件：37℃逆转录1 h；98℃酶灭火10 min。

1.3.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测使用mirVana™qRT-PCR miRNA 检测试剂盒对逆转录得到的cDNA 进行定量检测，反应体系总体积20 μl，包括逆转录产物2 μl，水7 μl，SYBR Mix 10 μl，PCR 正反向引物各0.5 μl。反应条件：95℃变性20 s，53℃退火30 s,72℃延伸30 s，循环35 次。miR-335正向引物：5'-TAAAGGGGGTTTTGTTTATT-3'，反向引物：5'-CCCACAAACTACCCACAAAC-3'。miR-497正向引物：5'-GTCCTATCCAGTGCAGGGT-3'，反向引物：5'-CCAGGTATTCCCACTCGGATAC-3'。以U6基因作为内参，U6引物序列，正向：5'-CGCTTCGG CAGCACATATAC-3'，反向：5'-AAATATGGAACGCT TCACGA-3'。根据2-△△Ct法计算miR-335、miR-497的相对表达量，-△△CtmiR-335=△CtmiR-335-△CtU6，-△△CtmiR-497=△CtmiR-497-△CtU6。以健康组和结直肠癌组血清miR-335、miR-497 相对表达量的均值作为相应的分组依据，其中，血清miR-335 相对表达量≥21.26 为高表达，＜21.26 为低表达。血清miR-497相对表达量≥18.06为高表达，＜18.06为低表达。

1.4 随访

随访方式以电话随访和门诊复查为主，当患者出现复发或死亡时随访结束。患者的生存时间为治疗结束日至末次随访日或治疗结束日至患者死亡日。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析；计数资料以例（%）表示，比较用χ2检验；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log rank χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-335、miR-497相对表达量的比较

两组血清miR-335 和miR-497 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），结直肠癌组低于健康组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组血清miR-335、miR-497相对表达量比较（n=99，±s）

表1 两组血清miR-335、miR-497相对表达量比较（n=99，±s）

组别健康组结直肠癌组t 值P 值miR-335 29.73±9.59 12.79±3.55 16.483 0.000 miR-497 26.16±8.44 9.95±2.76 18.163 0.000

2.2 结直肠癌患者不同因素血清miR-335 和miR-497 相对表达量的比较

不同年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、浸润深度、脉管浸润、神经浸润、淋巴结转移患者的血清miR-335 相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同TNM分期、分化程度的患者血清miR-335相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），TNM 分期Ⅰ、Ⅱ和高分化患者血清miR-335 相对表达量高于TNM分期Ⅲ和低分化患者。

不同年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、浸润深度、脉管浸润、神经浸润、淋巴结转移患者的血清miR-497 相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同TNM分期、淋巴结转移患者血清miR-497相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），浸润深度T1、T2，TNM分期Ⅰ、Ⅱ，及无淋巴结转移患者血清miR-497 相对表达量高于浸润深度T3、T4，TNM分期Ⅲ，及有淋巴结转移患者。见表2。

表2 结直肠癌患者不同因素间血清miR-335和miR-497表达水平的比较 （±s）

表2 结直肠癌患者不同因素间血清miR-335和miR-497表达水平的比较 （±s）

临床病理特征年龄＜60岁≥60岁性别miR-335 t/F 值P 值miR-497 t/F 值P 值13.05±4.21 12.29±3.41 1.165 0.247 10.21±3.29 9.45±2.63 0.908 0.366男女12.87±4.15 12.67±3.52 0.273 0.786 10.02±3.23 9.85±2.74 0.250 0.803

续表2

2.3 血清miR-335、miR-497表达水平与结直肠癌患者预后的关系

血清miR-335 高表达组患者的中位生存时间为55 个月，5年生存率为67.24%（39/58）。血清miR-335低表达组患者的中位生存时间41个月，5年生存率为48.78%（20/41）。两组比较，差异有统计学意义（χ2=5.594，P=0.018），血清miR-335 高表达组患者5年生存率高于低表达组患者。血清miR-49 高表达组患者的中位生存时间为55 个月，5年生存率为65.45%（36/55）。血清miR-497 低表达组患者的中位生存时间42个月，5年生存率为52.27%（23/44）。两组比较，差异有统计学意义（χ2=4.046，P=0.044），血清miR-497 高表达组患者5年生存率高于低表达组患者。见图1。

图1 血清miR-335、miR-497高低表达组生存曲线图

3 讨论

miRNA 能够与基因的信使RNA（mRNA）非编码区结合，促进mRNA 的降解，从而调控基因的表达水平[7]。一种miRNA 能够与多种基因的mRNA 结合，从而调控多种基因的表达，并且miRNA 之间也存在相互调控机制，因此在细胞中存在复杂的miRNA 调控途径[8]。通过RNA-seq和基因芯片等高通量技术发现在结直肠癌发生、发展过程中miRNA 途径发生紊乱，部分miRNA 的表达呈现显著上调和显著下调趋势，导致细胞的恶性增殖和肿瘤发生[9]。例如XU等[10]通过RNA-seq 技术对结直肠癌细胞进行RNA 组学高通量测序，发现众多miRNA 表达异常，并且存在十分复杂的miRNA-mRNA 调控途径。对结直肠癌中miRNA 的表达情况及其与预后的关系进行分析，对制订针对性干预措施以提高和改善患者的预后和生存具有重要意义。

miR-335 能够抑制肿瘤的发生、发展，在胃癌和甲状腺癌中miR-335 表达水平均下调[11]。首先，miR-335 能够抑制促癌基因的表达，继而抑制肿瘤细胞的恶性增殖，从而发挥抑癌基因的作用。如LIU等[12]的研究发现在胃癌中miR-335能够抑制生存素促癌基因的表达，进而促进胃癌细胞增殖。其次，miR-335能够抑制肿瘤增殖相关信号通路的活化，进而抑制肿瘤细胞的增殖。WANG等[13]发现在膀胱癌中细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK）信号通路中ERK1和ERK2基因均是miR-335 的直接作用靶点，miR-335 能够下调ERK1和ERK2基因表达，进而抑制ERK 信号通路的活化，从而抑制膀胱癌细胞增殖。本研究发现在结直肠癌患者中血清miR-335表达水平下降，表明miR-335可能起到抑癌基因的作用。进一步研究发现miR-335表达水平在TNM 分期较高、分化程度较低的结直肠癌患者中降低，表明miR-335 低表达可能与结直肠癌的恶性增殖和低分化密切相关。Kaplan-Meier 生存曲线结果显示miR-335 低表达患者的总生存率下降，表明miR-335 表达水平与结直肠癌患者的预后相关，并且miR-335 低表达结直肠癌患者预后较差。推测其原因，可能是由于人第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）、ERK和多聚ADP 核糖转移酶（PARP1）等基因均是miR-335 的作用靶点，而PTEN、ERK和PARP1是较强的促癌基因，能够有效促进肿瘤细胞增殖，同时降低肿瘤的分化程度，并且三者在MAPK、ERK 和凋亡相关信号通路中均起到关键作用，与肿瘤的恶性程度存在明显的正相关性，miR-335 抑制PTEN、ERK和PARP1表达能够有效降低结直肠癌的恶性程度，从而抑制结直肠癌发生发展[14-15]。

miR-497 是与肿瘤发病密切相关的miRNA，在骨肉瘤和乳腺癌中表达缺失，能够抑制肿瘤的发生、发展，并且miR-497 低表达与骨肉瘤和乳腺癌患者的不良预后密切相关[16]。miR-497 对肿瘤细胞的作用机制主要是通过调节癌基因表达完成的，miR-497 能够与癌基因mRNA 的非编码区结合，导致mRNA 的稳定性下降并促进核糖核酸酶对mRNA的降解，从而导致癌基因表达水平下降。例如CHENG 等[17]发现在肝癌细胞中胰岛素样生长因子受体1（IGF1R）癌基因是miR-497 的直接作用靶点，miR-497 能够下调IGF1R 癌基因表达，进而抑制肝癌发生发展。同时miR-497 也可与lncRNA 结合并介导lncRNA 降解，形成lncRNA-miRNA-mRNA 调控途径，lncRNA 与miR-497 的结合能够解除miR-497 对癌基因的抑制作用，从而促进肿瘤发生、发展。例如MA 等[18]研究发现在胃癌中miR-497 能够与长链非编码RNA X 染色体失活特异转录本（lnc RNA XIST）结合，从而解除miR-497 对人结肠癌转移关联基因1（MACC1）的抑制作用，进而促进胃癌细胞增殖和转移。其次，miR-497 能够同时抑制信号通路中多个基因的表达，进而抑制肿瘤增殖和转移相关信号通路的活化，导致肿瘤发生、发展受到抑制。例如TAO 等[19]发现在宫颈癌细胞中miR-497 能够负调控丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号通路的活化，进而促进宫颈癌细胞凋亡并抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭和转移。本研究结果发现，在结直肠癌患者中血清miR-497 表达水平下降，表明miR-497 表达水平可能与结直肠癌的发生、发展密切相关，并且在结直肠癌中可能起到抑癌基因的作用。进一步研究发现miR-497 表达水平在浸润深度较深、TNM分期较高、有淋巴结转移的结直肠癌患者中降低，表明miR-497 低表达可能与结直肠癌的侵袭和转移密切相关。Kaplan-Meier 生存曲线结果显示miR-497低表达患者的总生存率下降，表明miR-497 表达水平与结直肠癌患者的预后相关，并且miR-497 低表达结直肠癌患者预后较差。推测其原因，可能是由于miR-497 作为抑癌基因在肿瘤当中具有普遍性，miR-497 在结直肠癌中低表达导致miR-497 对MAPK信号通路的抑制作用下降，使得MAPK 信号通路异常活化，而MAPK 信号通路参与肿瘤侵袭、转移等过程，因此结直肠癌miR-497 表达下降会促进结直肠癌细胞侵袭和转移，导致结直肠癌细胞在患者体内扩散并形成相应转移灶，导致患者出现脏器衰竭而死亡[20]。

综上所述，血清miR-335、miR-497 在结直肠癌患者中的表达水平下降，且miR-497 表达水平与结直肠癌的侵袭和转移有关，而miR-335 表达水平与结直肠癌的恶性增殖和分化程度有关，两者的低表达与结直肠癌患者的不良生存预后有关。鉴于miR-335、miR-497 在多种肿瘤中均低表达，是否能作为结直肠癌的标志物还需要进一步深入研究，并且对两者在结直肠癌发生、发展过程中的分子机制仍需要进一步深入探究。