酿酒葡萄品种对绿盲蝽抗性的筛选及其挥发物初步鉴定

武海燕，高素红*，路常宽，李晓颖，崔 营

(1 河北科技师范学院农学与生物科技学院，河北 秦皇岛，066600；2 河北科技师范学院园艺科技学院)

随着葡萄种植面积不断扩大，葡萄产区常见的病虫害都呈现出了逐年加重的趋势[1～3]，其中又以绿盲蝽为主要害虫之一。绿盲蝽不仅为害葡萄的生长发育，还会给果农带来经济损失[4～5]。葡萄新梢生长点被绿盲蝽刺吸后会很快干枯，导致葡萄停止生长；葡萄嫩叶受绿盲蝽为害后，叶面上会有许多刺吸点，形成不规则、皱缩的孔洞，影响葡萄植株的长势；葡萄花蕾受绿盲蝽为害后，会影响葡萄的结果率，从而降低葡萄的产量；葡萄果粒受绿盲蝽为害后会影响葡萄的品质和出售[6]。因此加强葡萄种植过程中绿盲蝽的防控，已经成为果农的当务之急。

昆虫在寻找寄主的过程中多靠嗅觉来辨别位置，通过植物释放的挥发性物质来寻找合适的寄主植物，因此植物挥发物在昆虫选择寄主的过程中起着很大的作用。植物在适应病虫害、干旱等不良的外界环境的过程中，也形成了自身特有的防御机制。其中组成防御机制主要包括植物形态上的防御、一些植物次生化合物以及植物始终释放的能够吸引昆虫天敌的挥发性物质。该防御机制在植物全株表达，始终存在于植株中并发挥抗性作用[7]。同时，人们在对植物与昆虫互相作用的研究中发现，部分植物挥发性物质对昆虫有驱避、阻碍取食和诱集等作用[8，9]，不同品种植物对害虫的趋避也存在差异[10，11]。目前酿酒葡萄对绿盲蝽的抗性筛选以及其挥发物的研究较少，因此笔者对绿盲蝽在葡萄园区的取食、产卵行为以及不同品种酿酒葡萄苗叶片释放的挥发性物质进行研究，筛选对绿盲蝽具有抗性的酿酒葡萄品种，确定酿酒葡萄释放的挥发性化合物，为绿盲蝽植物源诱抗剂的开发和应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2014年定植的赤霞珠、2015年定植的小味儿多和玛瑟兰、2016年定植的梅鹿辄、2017年定植的霞多丽、维欧尼、烟七三、小芒森、贵人香、威代尔、蛇龙珠、赤龙珠12个品种均由昌黎县醉美酒庄提供，单臂篱架栽培；另一部分试验材料由河北科技师范学院农学与生物科技学院实训温室提供，为2017年春季扦插的赤霞珠、玛瑟兰、小味儿多、梅鹿辄、霞多丽5种酿酒葡萄苗，各供试材料生长状况良好。

1.2 试验药品与仪器

1.2.1药品 色谱纯二氯甲烷、50-80 mesh Porapak Q吸附剂(默克supelco)、活性炭。

1.2.2仪器 QC-1S气体采样仪(北京市科安劳保新技术公司生产)、2 mL棕色进样瓶、BTH-10型活化仪(北京踏实德研仪器有限公司生产)、2 L气体采样袋(上海申源科学仪器有限公司生产)、Agilent Techologies 7890/5975C气相色谱-串联质谱联用仪(美国Agilent公司生产)、移液枪、特氟龙管、立体显微镜等。

1.3 试验方法

1.3.1绿盲蝽对不同品种酿酒葡萄叶片为害的调查方法 2019年7月26日、8月30日、9月16日、9月30日、10月15日，采用平行线取样法，对昌黎县醉美酒庄12种酿酒葡萄叶片的绿盲蝽为害情况进行调查。每个品种任选一个试验小区，每个小区随机选取10个枝条，调查每根枝条上所有叶片被绿盲蝽刺吸为害的情况。按照以下叶片受害分级标准进行酿酒葡萄叶片受害指数的计算。

0级：葡萄叶片正常

1级：葡萄叶片被害面积占叶片总面积的比例为 <25%

2级：葡萄叶片被害面积占叶片总面积的比例为26%～50%

3级：葡萄叶片被害面积占叶片总面积的比例为51%～75%

4级：葡萄叶片被害面积占叶片总面积的比例为 >75%

叶片受害指数：

受害指数=Σ(受害级别×相应的叶片数量)/(最大受害级别值×叶片总数)×100

参考陈瀚[12]的方法并修改，采用抗性值累计量化，综合评价赤霞珠、玛瑟兰、霞多丽等供试酿酒葡萄品种对绿盲蝽的抗性指数(resistance index，RI)。将每次调查的叶片受害指数从大到小排列后，依次设为1～5的抗性值，即叶片受害指数最大的20%抗性值为1，叶片受害指数最小的20%抗性值为5。最后平均5次调查的抗性值，获得各品种酿酒葡萄的综合抗性指数，其中RI<2为高感(HS)，2≤RI<3为中感(MS)，3≤RI<4为中抗(MR)，RI≥4为高抗(HR)。

1.3.2不同品种酿酒葡萄上绿盲蝽越冬卵的调查方法 于2019年10月24日调查绿盲蝽越冬卵，从昌黎县醉美酒庄采集各品种酿酒葡萄的冬芽，每种供试酿酒葡萄选取21个枝条，共计冬芽总数大于200，带回实验室内用解剖针剖开冬芽，在显微镜下观察，记录冬芽内绿盲蝽越冬卵的数量，并对不同品种酿酒葡萄的叶片受害指数与绿盲蝽越冬卵量进行相关性分析。

1.3.3不同品种酿酒葡萄叶片挥发性物质的收集方法 参考于惠林[13]、李茂业[14]和曹扬[15]的试验方法，将2017年扦插的酿酒葡萄苗顶端的5片叶分别套上2 L的气体采样袋(采样袋长24 cm，宽22 cm)，然后用大气采样仪循环采集挥发性气体。田间采集时，气体采样袋其中的一个阀门用特氟龙管连接到大气采样仪进气的一端，另一个阀门用特氟龙管连接到大气采样仪出气的一端，进气口的空气通过活性炭过滤后进入大气采样袋，带有植物挥发性气体的空气被吸附管中的吸附剂吸附后回流入大气采样仪，形成一个密闭的循环装置。气体流量为300 mL·min-1，连续收集4 h(每30 min平衡10 min)后带回实验室用色谱纯二氯甲烷洗脱，并用氮气浓缩至0.5 mL，然后置于-20 ℃条件下储存备用，时间不超过3个月。

1.2.4酿酒葡萄叶片挥发性物质定性定量分析条件 色谱条件：色谱毛细管柱为HP-5MS色谱柱，载气为氦气，流速为1.0 mL·min-1。程序升温方式：60 ℃保持2 min，然后以5 ℃·min-1的速度升到250 ℃，保持10 min，进样量1 μL，溶剂延迟3 min。质谱条件：离子源为IE，离子源温度为230 ℃，电子能量为70 eV，质量扫描范围为10～425 amu。

1.2.5酿酒葡萄叶片挥发物相对含量计算 测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率。

2 结果与分析

2.1 不同品种酿酒葡萄叶片的受害情况

2019年7月26日至10月15日期间，绿盲蝽对不同品种酿酒葡萄的为害程度存在显著差异。2019 年7月26日，绿盲蝽对烟七三的为害程度最重，叶片受害指数为30.605 3，对玛瑟兰的为害程度最轻，叶片受害指数为12.584 6；2019年8月30日，小味儿多叶片受害最重，叶片受害指数为26.365 6，赤龙珠叶片受害程度最轻，叶片受害指数为16.507 4；2019年9月16日，各酿酒葡萄总体受害程度较均匀，绿盲蝽对霞多丽的为害程度最高，其叶片受害指数为19.997 1，玛瑟兰受害最轻，叶片受害指数为13.361 0；2019年9月30日，绿盲蝽仍然对霞多丽的为害程度最重，对玛瑟兰的为害程度最轻，叶片受害指数分别为23.822 7和14.758 5；2019年10月15日，绿盲蝽对小味儿多的为害程度显著高于其他酿酒葡萄品种，其叶片受害指数为27.068 9，玛瑟兰受害最轻，叶片受害指数为14.289 0(表1)。

表1 2019年7月26日～10月15日不同品种酿酒葡萄叶片的受害指数

2.2 不同品种酿酒葡萄对绿盲蝽的抗性水平

不同品种酿酒葡萄对绿盲蝽的抗性水平存在显著差异。其中玛瑟兰的抗性指数大于4，对绿盲蝽的表现为高抗；赤霞珠、小芒森、贵人香、维欧尼、威代尔、赤龙珠6个酿酒葡萄品种为中抗品种，3≤抗性指数<4；霞多丽、烟七三、蛇龙珠3个酿酒葡萄品种为中感品种，2≤抗性指数<3；小味儿多、梅鹿辄2个酿酒葡萄品种的抗性指数<2，为高感品种，其中小味儿多对绿盲蝽的抗性指数最低(图1)。

图1 2019年7月26日～10月15日不同品种酿酒葡萄对绿盲蝽的抗性指数

2.3 不同品种酿酒葡萄上绿盲蝽越冬卵量的调查

2019年10月24日调查结果显示，不同品种酿酒葡萄冬芽上绿盲蝽的越冬卵量存在显著差异(表2)。在12种酿酒葡萄冬芽中均发现了绿盲蝽越冬卵，其中威代尔冬芽上的越冬卵量最多，单芽卵量为1.282 7 粒，其次是维欧尼冬芽上的绿盲蝽越冬卵量，单芽卵量为1.240 0粒；绿盲蝽越冬卵量最少的酿酒葡萄品种为赤龙珠，单芽卵量为0.269 7 粒。并采用IBM SPSS Statistics 21进行Pearson 相关性分析，发现2019年不同品种酿酒葡萄叶片的受害指数与绿盲蝽越冬卵量之间无相关性，其相关系数为-0.138。

表2 2019年10月不同品种酿酒葡萄冬芽上绿盲蝽的越冬卵量

2.4 5种酿酒葡萄挥发性物质定性分析

选取不同抗性葡萄品种，从叶片中共鉴定出53种物质，其中从玛瑟兰叶片中鉴定出 17种化合物；从赤霞珠叶片中鉴定出 18种化合物；从小味儿多叶片中一共鉴定出 12种化合物；从梅鹿辄叶片中鉴定出 20种化合物；而从霞多丽叶片中鉴定出 20种化合物(图2，表3)。

图2 5种酿酒葡萄叶片挥发性物质的总离子流图

2.5 5种酿酒葡萄叶片挥发性物质定量分析

酿酒葡萄叶片中鉴定出的53种挥发性化合物按照化学结构可以分为多种种类。其中酯类最多，为 13种；其次是烃类 12 种；芳香类10种；酸6种；酮类4种；醇类3种；烯萜类、醛类、胺类各1种；其他2种。鉴定出的多种挥发性化合物中，4种酿酒葡萄共有的化合物有5种，包括邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、4’-乙苯乙酮、对异丙基苯丙酮、1,4-二乙酰苯；3种酿酒葡萄共有的化合物有邻苯二甲酸二辛酯、4-乙基苯甲酸、2,2-二甲基庚烷、氯酸钠化合物4种；2种不同酿酒葡萄共有的化合物包括3,4-二甲基苯甲酸4-叔丁基苯基酯、邻苯二甲酸二异丁酯、丁酸环己酯、2-乙基-4,5-二甲基苯酚、1,3,5-三乙基苯、1,2-二乙苯、1,4-二乙苯、正十六酸、正十五烷、正庚烷、二十四烷11种，剩余挥发性化合物均为各酿酒葡萄所特有。而且，不同品种酿酒葡萄叶片释放的同一类化合物的相对含量均存在一定的差异(表3)。

表3 5种酿酒葡萄叶片释放的挥发物的种类及其各组分相对含量(质量分数) %

3 结论与讨论

本次研究对绿盲蝽产卵选择性和取食选择性进行了调查与分析，明确了对绿盲蝽抗性较好的酿酒葡萄品种；对不同品种酿酒葡萄幼苗期叶片释放的挥发物进行GC-MS检测，明确了其种类和含量差异。

韦婉羚等[16]研究发现不同木薯品种上朱砂叶螨的为害程度不同；白宇等[17]依据平均受害指数对不同品种苜蓿的抗性进行评价，发现不同品种苜蓿对蓟马的抗性存在差异；杨宇晖等[18]对受绿盲蝽为害的棉花苗期、蕾期和铃期叶片指数进行分析，得出不同棉花品种的抗虫性存在显著差异的结论。本文对昌黎县醉美酒庄酿酒葡萄叶片的受害情况以及绿盲蝽越冬卵量进行调查分析，发现绿盲蝽对赤霞珠、威代尔、维欧尼、蛇龙珠、梅鹿辄、小芒森、贵人香、烟七三、霞多丽、玛瑟兰、小味儿多、赤龙珠12种酿酒葡萄叶片的为害情况存在显著差异，其中玛瑟兰为高抗品种，赤霞珠、小芒森、贵人香、维欧尼、威代尔、赤龙珠为中抗品种，霞多丽、烟七三、蛇龙珠为中感品种，小味儿多、梅鹿辄为高感品种，说明不同植物品种对同一害虫的抗性不同。对绿盲蝽越冬卵的数据进行分析，表明不同品种酿酒葡萄上的绿盲蝽越冬卵量差异显著，同时由绿盲蝽越冬卵量与不同品种酿酒葡萄受害指数之间的Pearson 相关系数可知，绿盲蝽在不同酿酒葡萄品种上的为害情况与其越冬卵量存在显著差异，表明不同酿酒葡萄对绿盲蝽取食和产卵行为的影响不同。

张立娟[19]研究发现寄主植物释放的挥发物种类和含量会影响绿盲蝽对寄主的选择，同时由植物的组成防御机制推测，不同品种酿酒葡萄抗性不同的原因可能是植物本身产生的次生代谢物质不同，从而影响了绿盲蝽对寄主的选择。因此本文选择玛瑟兰、赤霞珠、霞多丽、梅鹿辄和小味儿多5种酿酒葡萄苗，对其挥发物进行比较与分析。结果表明不同抗性的酿酒葡萄，其释放的挥发物在成分及含量上都存在差异。部分挥发性化合物都曾进行过研究分析，例如邻苯二甲酸二丁酯在浓度为0.1 μL·mL-1时，对黄曲条跳甲雌虫具有趋避作用[20]；稀释 100 倍的邻苯二甲酸二丁酯，对莲草直胸跳甲成虫表现出显著的忌避作用，而原药和稀释 1000 倍的浓度却无显著影响[21]；邻苯二甲酸二甲酯在浓度为1.00 mol·L-1时对日本双棘长蠹成虫具有驱避作用，但在浓度为0.01 mol·L-1时即不具有趋避性也不具有引诱性[22]；棕榈酸甲酯在稀释浓度为10-2或10-4时对普通大蓟马具极显著驱避作用，在稀释浓度为10-6时对普通大蓟马即没有驱避作用也没有引诱作用[23]；二十四烷在浓度为5×10-3g·mL-1时对亚洲玉米螟初孵幼虫的取食行为具有趋避作用[24]。已经确定这些物质在一定浓度下对害虫具有趋避性，因此推测其对绿盲蝽的行为反应可能也具有一定的影响，但具体为趋避性还是引诱性需要进一步分析，后续会进行相关研究。酿酒葡萄对绿盲蝽的抗性受多种因素的影响，如植物的形态防御、植物的次生化合物以及植物释放的挥发性物质等组成防御机制，一直存在于葡萄植株中并对害虫起到抗性作用。本研究表明越冬卵量不是影响绿盲蝽取食行为的主要因素，更可能受一些挥发性物质的影响，具体的行为反应有待进一步深入研究。