异菌脲与戊唑醇、吡唑醚菌酯复配对 苹果斑点落叶病菌的联合毒力*

鄢海峰，周宗山

（中国农业科学院果树研究所，辽宁兴城 125100）

苹果斑点落叶病是世界范围内苹果重要病害之一，在我国各个苹果产区均有发生[1]。苹果斑点落叶病主要危害苹果叶片，也危害新梢和果实，是‘新红星’等元帅系苹果的重要病害，在持续降雨及雨后湿度大的天气容易暴发[2-3]，严重时影响树势及花芽形成，并且造成大量落叶，影响果实膨大和着色。在发病后期，病菌可以侵染果实，致使果实品质下降，造成严重的经济损失[4-6]。苹果斑点落叶病由链格孢苹果专化型（Alternaria alternata f.sp.mali）引起[7]，杀菌剂抗药性行动委员会（FRAC）将Alternaria alternata 归类为对杀菌剂有很高抗药性风险的植物病原菌，对生产中使用杀菌剂产生抗药性有高风险[8]。虽然抗性品种是防控该类病害的最经济、环保的方法，但在缺少抗性品种或抗性不完整的情况下，使用化学药剂仍是防控作物真菌病害的主要手段[9]。

戊唑醇是麦角甾醇抑制类（sterol demethylation inhibitors，DMIs）杀菌剂，在农业生产中应用最广泛，兼具有保护、治疗的作用[10]。抗药性风险评估研究表明，苹果斑点落叶病菌对戊唑醇敏感性研究结果有差异，且随着用药时间的延长，菌株对药剂的敏感性下降[11-12]。二甲酰亚胺类（dicarboximides，DCs）包括异菌脲和腐霉利等，是20 世纪后期开发的一类触杀型保护性杀菌剂，也具有一定的治疗作用，可有效抑制真菌孢子萌发及菌丝生长[13]。二甲酰亚胺类杀菌剂的广泛应用，很容易使病原菌产生抗药性，且抗药性形成时间短、频次高[14]，已有DCs杀菌剂在多种病害上产生抗药性的报道[15-18]。吡唑醚菌酯是甲氧基丙烯酸酯类（quinone outside inhibitors，QoIs）杀菌剂，主要是抑制病菌孢子萌发及菌丝生长所需能量的产生，具有内吸活性，杀菌谱广且高效低毒，有保护、治疗、铲除功能，但作用位点单一，属“高抗性风险”药剂[19]。在大量使用该农药的作物上，抗性发展极为迅速[20]。

为延缓病菌对杀菌剂的抗药性产生，开展预防性抗性治理，尽可能延长杀菌剂的使用寿命，采用不同作用机制的杀菌剂交替或复配使用是延缓或阻止病原菌抗药性加剧的主要策略之一[21]。复配杀菌剂能形成多位点作用机制，除了保护和延长高效中到高抗性风险杀菌剂的寿命外，复配杀菌剂还提供了额外的疾病控制水平和范围[22-23]。在一些作物中，复配剂的使用在病害防治中发挥着越来越重要的作用，以维持有效的病害控制和抗性管理[24]。为此，本研究开展了筛选异菌脲与戊唑醇、异菌脲与吡唑醚菌酯2 种复配剂的增效比例，探明戊唑醇与异菌脲、吡唑醚菌酯与异菌脲2 种复配对苹果斑点落叶病菌是否具有增效作用，通过联合毒力测定，最终选出2 种混剂的最佳配比，为研制防治苹果斑点落叶病菌的混配药剂提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌珠

苹果斑点落叶病菌（Alternaria alternata f.sp.mali）菌株由中国农业科学院果树研究所植物保护中心分离、保存。

1.2 试验药剂

97%异菌脲（iprodione）原药、85%戊唑醇（tebuconazole ）原药和95% 吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）原药由沈阳化工研究院司乃国研究员馈赠；500 g/L 异菌脲可湿性粉剂由富美实有限公司生产；430 g/L 戊唑醇悬浮剂由山东烟台科达化工有限公司生产。

1.3 试验方法

1.3.1 室内毒力测定

（1）单剂毒力测定。采用菌丝生长速率法测定苹果斑点落叶病菌对异菌脲、戊唑醇、吡唑醚菌酯3 种单一药剂的敏感性。异菌脲、戊唑醇和吡唑醚菌酯原药用二甲基亚砜（DMSO）配制成母液备用，将PDA 培养基熔化，冷却至50 ℃时加入杀菌剂充分混匀，配制含异菌脲5、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL 系列浓度的PDA 平板，含戊唑醇10、5、1、0.5、0.25 μg/mL 系列浓度的PDA 平板，含吡唑醚菌酯20、10、5、1、0.5、0.25 μg/mL 系列浓度的PDA平板，以不含药剂的PDA 平板作对照。在PDA 平板中央接种1 个直径5 mm 的菌饼，每个处理重复4次，24 ℃下黑暗培养7 d，直角测量每个菌落直径2 次，计算菌丝生长抑制率。

（2）最佳配比筛选。采用Horsfall 交互测定法进行最佳配比的筛选[25]。异菌脲与戊唑醇2 种单剂用无菌水分别配制成剂量浓度与其EC50相同或相近的药液，2 种药液分别按体积比0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0 进行复配，按照上述单剂毒力测定方法处理供试菌，以不含药剂的PDA 平板作对照，共12 个处理，1 个PDA 平板为1 次重复，每个处理4 次重复，异菌脲与吡唑醚菌酯复配方法及处理同上，计算各复配药剂的菌丝生长抑制率及毒性比率。

毒性比率小于0.75 时，表现为拮抗作用；毒性比率在0.75～1.25 时，表现为相加作用；毒性比率大于1.25 时，表现为增效作用。根据毒性比率初步筛选出最佳配比。

（3）混配杀菌剂联合毒力测定。根据不同比例复配杀菌剂的毒力结果筛选出的最佳配比，对苹果斑点落叶病菌分别取异菌脲与戊唑醇EC50值剂量比例为6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，异菌脲与吡唑醚菌酯EC50值剂量比例为6∶4、7∶3、8∶2、9∶1各4 个比例作联合毒力验证，采用Wadley 法进行评价[26]。

EC50（A）、EC50（B）分别代表混剂中A 药剂和B 药剂的EC50实测值；EC50（ob）、EC50（th）分别代表混剂的EC50实测值和理论值；PA、PB分别代表A 药剂和B药剂在混剂中的百分含量，单位为%；SR 代表增效系数，SR＞1.5 为增效作用，1.5≥SR≥0.5 为相加作用，SR＜0.5 为拮抗作用。

1.3.2 田间药效试验

2020 年，在辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所温泉试验场苹果园进行田间药效试验。试验园为平地，管理一般，苹果品种为‘金冠’，行株距5 m×3 m，树龄6 年，树势中庸，苹果斑点落叶病常年发生。

试验药剂为500 g/L 异菌脲可湿性粉剂和430 g/L 戊唑醇悬浮剂的混合物（异菌脲与戊唑醇的质量比为4∶1），浓度分别为3 000 倍液、4 000 倍液、5 000 倍液，对照药剂为500 g/L 异菌脲悬浮剂1 500倍液和430 g/L 戊唑醇悬浮剂5 000 倍液，以清水处理为空白对照。试验共设6 个处理，3 株苹果树为1 个试验小区，每个处理3 次重复，共18 个小区，随机区组安排。用利农手压背负式喷雾器全树喷雾，均匀喷洒。

叶片发病初期喷第1 次药，喷药前调查发病基数，共施药5 次，间隔7 d，最后1 次喷药后7 d 调查防效。病叶分级标准参照农业行业标准《农药田间药效试验准则》[27]，每小区随机选取10 个新梢，每个新梢自上而下调查全部叶片，记录总叶片数、各级病叶数，计算病情指数和防治效果。对防效进行方差分析（SPSS 统计软件），采用邓肯氏新复极差法（DMRT）检验药剂平均防效的差异显著性。

CK 为空白对照区施药后病情指数，PT 为药剂处理区施药后病情指数。

2 结果与分析

2.1 室内毒力测定

2.1.1 3 种杀菌剂对苹果斑点落叶病菌的毒力

单剂毒力测定结果表明，异菌脲、戊唑醇和吡唑醚菌酯3 种单剂对苹果斑点落叶病菌菌丝生长均有良好的抑制作用，对苹果斑点落叶病菌的EC50值分别为0.678 6、2.762 7、7.933 1 mg/L（表1）。

表1 异菌脲、戊唑醇和吡唑醚菌酯对苹果斑点落叶病菌的毒力

2.1.2 不同比例复配杀菌剂对苹果斑点落叶病菌的毒力

复配剂毒力测定结果表明：异菌脲与戊唑醇EC50值剂量比例为6∶4、7∶3、8∶2 和9∶1 时，对苹果斑点落叶病菌的毒性比率分别为1.35、1.45、1.50、1.41，表现为增效作用；比例为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6 和5∶5 时，表现为相加作用。异菌脲与吡唑醚菌酯EC50值剂量比例为9∶1 时，对苹果斑点落叶病菌的毒性比率为1.26，表现为增效作用；比例为3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3 和8∶2 时，均表现为相加作用（表2）。

表2 异菌脲与戊唑醇、吡唑醚菌酯不同复配比例对苹果斑点落叶病菌的毒性比率

2.1.3 最佳配比对苹果斑点落叶病菌的联合毒力

结果表明，异菌脲和戊唑醇不同配比的混合物对苹果斑点落叶病菌表现不同程度的抑制作用，异菌脲和戊唑醇EC50值剂量比例为8∶2（实际含量比为4∶1）的增效系数为1.57，表现为增效作用；比例6∶4、7∶3 和9∶1 配比混剂对苹果斑点落叶病菌的增效系数分别为1.27、1.42、1.29，表现为相加作用（表3）。

异菌脲与吡唑醚菌酯EC50值剂量比例6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 配比混剂对苹果斑点落叶病菌的增效系数分别为1.09、1.12、1.14、1.41，均介于0.5～1.5 之间，表现为相加作用，其中比例9∶1 的增效系数明显高于其他3 个配比（表3）。

表3 异菌脲与戊唑醇、吡唑醚菌酯不同复配比例对苹果斑点落叶病菌的联合毒力

2.2 田间防治效果

田间试验表明：异菌脲与戊唑醇的复配剂（质量比4∶1）中，稀释倍数3 000 的防效最高，为78.90%，显著高于稀释倍数4 000、5 000 的防效和单剂对照500 g/L 异菌脲可湿性粉剂1 500 倍液、430 g/L 戊唑醇悬浮剂5 000 倍液的防效；异菌脲与戊唑醇的复配剂（质量比4∶1）稀释倍数4 000 和5 000的防效分别为73.24%、70.77%，二者差异显著，也均显著高于500 g/L 异菌脲可湿性粉剂1 500 倍液、430 g/L 戊唑醇悬浮剂5 000 倍液的防效（表4）。

表4 异菌脲与戊唑醇复配剂对苹果斑点落叶病菌的田间防治效果

3 结论与讨论

长期、连续地使用单一的杀菌剂会导致单一作用位点的杀菌剂更快地产生抗药性，防治成本较高，并且可能致使病害的流行发展、严重的农作物损失，最终导致生产中常用杀菌剂的失效[28]。为降低苹果斑点落叶病菌对常用杀菌剂产生抗性的风险，扩大防治谱及降低使用成本，利用现有农药进行混配是有效途径之一[29]。因此，本试验对2 种作用机制不同的杀菌剂的混配进行研究，旨在增加药效，延缓抗药性的发生。

室内联合毒力测定结果表明，异菌脲与吡唑醚菌酯复配在所测的4 个EC50值剂量比均对苹果斑点落叶病菌表现出相加作用，EC50值剂量比例为9∶1（实际含量比为1∶1）的增效系数最大。异菌脲和戊唑醇EC50值剂量比为8∶2（实际含量比为4∶1）的混合物，对抑制苹果斑点落叶病菌菌丝的生长表现出明显增效作用。田间药效试验结果表明，异菌脲与戊唑醇复配质量比4∶1 时，3 000～5 000 倍液的防效显著高于500 g/L 异菌脲可湿性粉剂1 500 倍液和430 g/L 戊唑醇悬浮剂5 000 倍液的防效，有效成分含量也更低，由此证明这2 种农药具有混配的可行性。

同时，有报道称吡唑醚菌酯与戊唑醇复配对葡萄炭疽病的防治呈现了明显增效作用[30]。吡唑醚菌酯与异菌脲的复配对防治苹果褐斑病菌也表现增效作用[31]。异菌脲与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的复配与单剂相比增效明显，且扩大了杀菌谱[29]。本研究筛选了异菌脲与戊唑醇、异菌脲与吡唑醚菌酯复配增效比例，结果表明，异菌脲和戊唑醇以质量比4∶1 复配时对苹果斑点落叶病菌增效作用最高，对苹果斑点落叶病的防效随用药浓度的增加而提高，推荐使用浓度3 000～4 000 倍液。