6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶4对癌细胞的增殖及迁移的影响及机制研究

高瑞芳， 荀 敬， 李宁昕， 李 霞， 张 颖， 沈丽琳， 罗 娜， 刘洪斌

卵巢癌是影响女性健康和生命的严重疾病，其死亡率位居妇科恶性肿瘤之首[1]。全球范围内，每年有23.9万例新病例（占所有癌症病例的3.6%）和15.2万例死亡病例（占所有癌症死亡人数的4.3%）[2]。研究表明，卵巢癌细胞的致癌性取决于它们的糖酵解表型，糖酵解活性越高的细胞侵略性越强[3]。因此，糖酵解过程涉及的关键酶可能成为卵巢癌治疗的重要靶点。

6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶 4（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase-4，PFKFB4）是糖酵解过程中的关键酶。它同时具有激酶活性和磷酸酶活性，能通过磷酸化和去磷酸化的双重作用维持细胞内果糖-2，6-二磷酸的水平，而果糖-2，6-二磷酸是糖酵解限速酶PDK1的主要变构激活剂，因此，PFKFB4能通过调节果糖-2，6-二磷酸的水平来控制糖酵解过程[4]。本研究组前期通过数据库分析发现，PFKFB4在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌的不良预后相关，但PFKFB4在卵巢癌细胞增殖和转移中的作用尚不清楚。本研究以人卵巢癌A2780细胞为研究对象，通过构建PFKFB4沉默和过表达稳定细胞系，初步探讨PFKFB4对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响，为进一步探讨PFKFB4基因在卵巢癌中的作用及其分子机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞系和主要试剂 人卵巢癌细胞株A2780购自中国科学院武汉细胞库，Lipo-fectamineTM2000细胞转染试剂和RNA提取试剂TRIzol均购自美国Invitrogen公司，RNA逆转录试剂盒和qPCR试剂盒购自北京Transgene公司，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司，PFKFB4抗体购自美国Abcam公司，β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Western blotting检测试剂盒购自美国Millipore公司，CCK-8试剂盒购自日本Dojindo Molecular Technologies公司，慢病毒基因沉默载体（pLV-H1-EF1α-puro）和过表达载体（pLV-EF1α-MCS-IRESBsd）购自Biosettia公司，Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 慢病毒包装及稳定细胞系的构建 利用LipofectamineTM2000将前期构建好的PFKFB4沉默 质 粒（pLV-shPFKFB4#1、pLV-shPFKFB4#2）、过表达质粒（pLV-PFKFB4）及相应空载体质粒（pLV-SC、pLV-MCS）[5]分别与3个慢病毒包装质粒（Gag-Pol、Rev和VSV-G）共转染293T细胞，40 h后收取病毒，得到的病毒经-80 ℃过夜处理后用于感染A2780细胞；感染前1天，将A2780细胞以每孔1×105个的密度铺种6孔板，当细胞密度达到10%～25%时，感染相应病毒，48 h后，用嘌呤霉素（Puro）或杀稻瘟菌素（Bsd）进行筛选，待野生型细胞完全死亡后停止筛选，存活的细胞扩大培养并收取蛋白和总RNA，通过qPCR和Western blotting验证PFKFB4的沉默和过表达效果后冻存备用。

1.3 qPCR检测PFKFB4 mRNA的表达 收集A2780细胞并用TRIzol裂解液提取细胞总RNA，通过逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，进而通过qPCR检测PFKFB4的mRNA表达。所用引物序列：PFKFB4 F为5'-GGGTGCCTCTTGGCCTTAAA-3'，R 为 5' -GCCCACACGGCATACTTTTC-3' ；GAPDH F 为5' -CTCTGATTTGGTCGTATTGGG-3' ，R为5′-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3' 。qPCR反应条件为：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 10 s， 60 ℃退火延伸20 s，共40个循环。以GAPDH作为内参基因，利用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平。

1.4 Western blotting实验检测PFKFB4蛋白的表达 用RIPA裂解液提取A2780细胞总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒对样品进行定量，样品变性后，进行SDS-PAGE、转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，孵育PFKFB4一抗（1∶1 000）和β-actin一抗（1∶5 000），4 ℃过夜，孵育HRP标记的二抗（1∶5 000），室温1 h，最后在曝光仪中进行ECL工作液显色成像。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖能力 将A2780细胞以3000个/孔的密度接种于96孔板，于37 ℃、5% CO2培养箱连续培养，分别于0、24、36、48、60、72 h检测，检测时每孔加入10 μ L CCK-8试剂后，置于37 ℃、5% CO2培养箱2 h，用酶标仪检测450 nm波长的吸光度值，绘制细胞增殖曲线。

1.6 克隆形成实验检测细胞增殖能力 将A2780细胞按照5000个/孔的密度铺种6孔板，于37 ℃、5% CO2培养箱培养7 d左右，克隆形成后，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫溶液室温染色5 min，拍照并记录各组细胞形成的克隆数。

1.7 划痕愈合实验检测细胞迁移能力 将2780细胞铺种6孔板，待细胞长满后，用10 μL枪头在各组细胞中间划一条垂直于背面平行线的直线，将正常培养基更换成含1%胎牛血清的RPMI-1640培养基，分别于划痕后的0 h和24 h拍照记录细胞的迁移情况，并用软件测量细胞的迁移距离。

1.8 Transwell实验检测细胞迁移能力 将A2780细胞用含1%胎牛血清的RPMI-1640培养基制成单细胞悬液，铺种于Transwell小室的上室（2×104细胞/小室），下室中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。37 ℃、5% CO2培养箱常规培养24 h，用棉签将小室内未迁移的细胞轻轻擦去，迁移至小室下表面的细胞用4%多聚甲醛室温固定5 min，0.1%结晶紫溶液室温染色5 min，于光学显微镜下观察并拍照计数。以上实验均重复3次。

1.9 葡萄糖和乳酸含量的测定 将细胞铺种于96孔板，每孔1×104个细胞，24 h之后收集上清，分别用BioVision公司的glucose colorimetric assay kit对上清中的葡糖糖浓度进行检测，用lactate colorimetric assay kit对上清中的乳酸浓度进行检测。

1.10 活性氧(ROS)含量的检测 采用Thermo公司的ROS敏感探针CM-H2DCFDA对细胞进行染色，具体步骤按照Thermo公司提供的操作说明进行。用5 μmol/L的CM-H2DCFDA对细胞进行染色，37 ℃孵育30 min，然后用PBS清洗2遍。染色完成之后，用流式细胞仪检测细胞的CM-H2DCFDA荧光强度，作为ROS的水平。

1.11 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，用GraphPad Prism 7软件进行绘图。正态分布的数据以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建沉默和过表达PFKFB4的卵巢癌A2780稳定细胞系 qPCR和Western blotting实验结果显示，PFKFB4沉默组（shPFKFB4#1、shPFKFB4#2组）A2780细胞中PFKFB4的mRNA（图1A）和蛋白（图1B）水平显著低于空载体对照组（SC组），差异有统计学意义（P＜0.05）；PFKFB4过表达组（PFKFB4组）A2780细胞中PFKFB4的mRNA（1图C）和蛋白（1图D）水平显著高于空载体对照组(MCS组)，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明，沉默和过表达PFKFB4的A2780稳定细胞系构建成功。

图1 A2780稳定细胞系中PFKFB4 mRNA和蛋白水平

2.2 PFKFB4促进卵巢癌A2780细胞的增殖 CCK-8实验和克隆形成实验结果显示，shPFKFB4#1组和shPFKFB4#2组A2780细胞的增殖（图2A）和克隆数量（图2B、2C）显著低于SC组，差异有统计学意义（均P＜0.05）；PFKFB4组A2780细胞的增殖（图2D）和克隆数量（图2E、2F）显著高于MCS组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。表明PFKFB4可促进卵巢癌A2780细胞的增殖。

图2 PFKFB4对卵巢癌A2780细胞增殖的影响

2.3 PFKFB4促进卵巢癌A2780细胞的迁移 划痕愈合实验和Transwell实验结果显示，与对照组比较，shPFKFB4#1组和shPFKFB4#2组A2780细胞的迁移距离显著减小，差异有统计学意义（P＜0.05，图3A、3B），迁移数量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，图3C、3D）；PFKFB4组A2780细胞相比对照组迁移距离显著增大，差异有统计学意义（P＜0.05，图 3E、3F, P＜0.05），迁移数量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05，图3G、3H）。表明PFKFB4可促进卵巢癌A2780细胞的迁移。

图3 PFKFB4对卵巢癌A2780细胞迁移的影响

2.4 PFKFB4促进卵巢癌A2780细胞的糖酵解 葡萄糖摄取、乳酸分泌以及ROS水平检测结果显示，与对照组比较，shPFKFB4#1组和shPFKFB4#2组A2780细胞的葡萄糖摄取（图4A）和乳酸分泌（图4B）显著减少，细胞内ROS水平（图4C）显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；PFKFB4组A2780细胞比对照组的葡萄糖摄取（图4D）和乳酸分泌（图4E）显著增加，细胞内ROS的水平（图4F）显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明PFKFB4可促进卵巢癌A2780细胞的糖酵解。

图4 PFKFB4对卵巢癌A2780细胞糖酵解的影响

3 讨论

代谢改变在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色[6-7]，参与肿瘤细胞核心代谢过程的关键酶对肿瘤细胞的存活和增殖具有不可或缺的作用[8-10]，靶向糖酵解过程为肿瘤的治疗提供了一个新的方向和思路。本研究通过构建沉默和过表达PFKFB4的卵巢癌A2780稳定细胞系发现，PFKFB4对卵巢癌细胞的增殖和迁移具有促进作用。

PFKFB4是控制糖酵解过程的关键酶，在多种肿瘤中的表达水平均高于其对应的正常组织[11-12]。Dasgupta等[8]研究发现，PFKFB4可磷酸化类固醇受体共激活因子-3(SRC3)，从而共激活ER并促进细胞增殖，高表达SRC3和PFKFB4的乳腺癌患者具有不良预后。在本课题组的前期工作中，通过免疫组化染色也发现PFKFB4在乳腺癌组织中高表达，并且与乳腺癌的恶性程度呈正相关[13]。通过分析高通量表达数据，Ros等[14]发现PFKFB4的高水平预示着乳腺癌和非小细胞肺癌患者的生存期缩短。Yun等[15]报道PFKFB4是非肌肉浸润性膀胱癌的预后标志物。这些研究表明，PFKFB4可能是一个潜在的肿瘤治疗靶点。然而，PFKFB4在卵巢癌中作用和机制尚不清楚。

本研究成功构建了PFKFB4沉默和过表达的卵巢癌A2780稳定细胞系，并通过实验验证了PFKFB4的沉默和过表达效果，为后续探讨PFKFB4基因的功能及在卵巢癌中的作用提供了理想的细胞模型。利用构建好的PFKFB4沉默和过表达细胞模型，分别通过CCK-8和克隆形成实验检测细胞的增殖，划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞迁移。结果显示，沉默PFKFB4抑制，而过表达PFKFB4促进A2780细胞的增殖和迁移，提示PFKFB4在卵巢癌中具有促癌作用，这与PFKFB4在其他肿瘤中的研究结果是一致的[16-17]。Taylor等[18]研究结果显示，沉默PFKFB4能够导致有丝分裂受阻的卵巢癌细胞的死亡，这与本研究结果证明的PFKFB4在卵巢癌中的促癌作用也是一致的。

肿瘤细胞的糖酵解受到不同酶促反应的调节，使葡萄糖衍生的碳单元能够进入其他合成代谢途径，如蛋白质和核苷酸的生物合成等。已有研究报道，PFKFB4由缺氧诱导，是缺氧诱导的糖酵解反应所必需的[19]。PFKFB4能够通过变构调节来控制糖酵解和磷酸戊糖途径代谢通量，从而平衡合成代谢和氧化还原稳态。研究表明，PFKFB4在前列腺癌中能够通过平衡糖酵解活性和抗氧化产物，维持细胞的氧化还原平衡。PFKFB4在转移性前列腺癌细胞中的mRNA表达高于其对应的原发肿瘤，通过RNAi的无偏性筛选表明，PFKFB4的基因敲除可阻断前列癌细胞的生长，并引起前列腺癌异种移植瘤的消退，证明前列腺癌细胞依赖PFKFB4而生存[9]。本研究检测了沉默和过表达PFKFB4对卵巢癌细胞糖酵解的影响。结果显示，PFKFB4在卵巢癌细胞中发挥促进糖酵解的作用，与文献报道一致，提示PFKFB4可能通过增强糖酵解来促进卵巢癌细胞的增殖和迁移。

综上所述，本研究通过构建PFKFB4沉默和过表达的稳定细胞系，证明PFKFB4可抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移；机制方面，PFKFB4可能通过增强糖酵解来促进卵巢癌细胞的增殖和迁移，其具体的机制还有待深入探讨。本研究结果为PFKFB4基因作为卵巢癌临床诊断和治疗的靶点提供了实验依据。