基于网络药理学探究黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性的作用机制

夏亚飞，潘博宇，阎 姝*

1.天津市南开医院 药剂科，天津 300100

2.天津大学中西医结合医院，天津 300100

外周神经毒性是抗肿瘤药物导致外周神经功能紊乱表现的症状与化疗所致的体征，患者常表现出对称性、从肢体远端开始的感觉异常、麻术、腱反射消失、肌肉痉挛甚至疼痛等临床症状[1]。铂类、紫杉醇类和长春碱类等化疗药物能够导致恶性肿瘤患者出现外周神经毒性[2-3]。目前临床常用维生素类、鼠神经生长因子、核苷酸类、钙剂、镁剂、还原型谷胱甘肽等营养神经类药物治疗化疗引起的外周神经毒性[4-7]。多数抗肿瘤药物均可以引起外周神经毒性，使患者生存质量下降，化疗引起的神经毒性已成为抗肿瘤药物剂量限制或停止使用的直接原因。因此，有效降低化疗引起的神经毒性是目前恶性肿瘤治疗的重要问题。

传统医学并没有“化疗后外周神经毒性”的相关记载，根据外周神经毒性临床表现出的四肢感觉异常、麻术疼痛、腱反射消失、肌肉痉挛等症状，可以将外周神经毒性归属到中医学的“血痹”“痹症”“麻木”等范畴。《丹溪心法》认为，手足麻为气虚所致，手足木则为痰湿血瘀所致；《素问·五脏生成》认为，血凝于肤即为痹。由此可见，对神经病变的治疗应以补气活血、逐瘀通络为主。黄芪与桂枝相配有通经络、利血脉、止痹痛之效，为临床常用的药对。黄芪可补营卫之气、益营卫之源，意为治血先治气，气行则血行，黄芪入脾肺，温分肉，实营卫，益气固卫、振奋阳气；桂枝辛温，具有辛能发散、温阳助卫、行营通痹之功效，协黄芪达表而运行气血。现代药理学研究表明，黄芪具有抗癌、增强造血功能的作用[8]；桂枝具有抗炎、抗凝血作用[9]；黄芪、桂枝可以扩张血管、改善末梢循环血供，从而促进肢体血液循环。

基于网络大数据分析的网络药理学，能以系统的方式揭示中药及复方的潜在作用机制，从而为加快中药现代化研发提供强有力的工具。本研究采用网络药理学方法，对黄芪-桂枝药对的潜在活性成分、作用靶点及相关信号通路进行分析，预测黄芪-桂枝药对治疗化疗引起的神经毒性的作用机制，以期为黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性的临床应用提供依据，并为复方制剂的开发提供指导。

1 材料与方法

1.1 黄芪与桂枝潜在活性成分的筛选及其作用靶点信息

通过传统中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）[10]检索黄芪与桂枝的主要活性成分，根据吸收、分布、代谢和排泄（absorption，metabolism，distribution and excretion，ADME）相关参数进行筛选，设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug-likeness，DL）≥0.18。通过文献挖掘黄芪与桂枝中同时满足以上条件的成分，汇总后得到黄芪与桂枝的主要活性成分。利用TCMSP 数据库查询主要活性成分对应的靶点，并采用Uniprot在线数据库查询靶点对应的基因名，选择物种为“Homo sapiens”，建立数据集。将活性成分与对应的靶点导入Cytoscape 3.2.1 软件进行网络关系可视化。

1.2 黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性潜在作用靶点的预测

检索GeneCards 在线数据库，以“neurotoxicity of chemotherapy”为关键词，获得与化疗引起的神经毒性相关靶点的数据集。使用TBtools 软件“Wonderful Venn”功能，提取药物与疾病交集靶点作为黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性潜在作用靶点。

1.3 黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性网络的构建

将黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性潜在作用靶点与其对应的潜在活性成分导入Cytoscape 3.2.1 软件，构建黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性的关系网络图。

1.4 黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性潜在作用靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction network，PPI）网络的构建

将黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性潜在作用靶点输入STRING 数据库，选择物种为“Homo sapiens”，置信度设为0.700，下载PPI 结果；导入Cytoscape 3.2.1 软件进行PPI 网络可视化。采用CytoNCA 插件筛选PPI 网络中的核心靶点，并利用Network Analyzer 计算核心靶点的度值。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

使用DAVID 在线分析平台对核心靶点进行GO功能和KEGG 通路富集分析，设置P＜0.05，采用OmicShare 云平台进行可视化作图。

2 结果

2.1 黄芪-桂枝药对潜在活性成分的筛选及其作用靶点的收集

如表1所示，共筛选得到黄芪-桂枝药对潜在活性成分38 个，其中黄芪24 个、桂枝14 个。黄芪-桂枝药对潜在活性成分与靶点网络见图1，黄芪对应377 个靶点，桂枝对应142 个靶点，合并去掉重复后，黄芪-桂枝药对共含442 个靶点。

表1 黄芪-桂枝药对潜在活性成分Table 1 Potential active ingredients of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus

图1 黄芪-桂枝药对潜在活性成分与靶点网络Fig.1 Network of potential active compounds and targets of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus

2.2 黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性作用靶点

如图2所示，共检索得到化疗引起的神经毒性相关靶点1543 个，黄芪-桂枝药对防治化疗引起神经毒性的潜在作用靶点242 个。

图2 黄芪-桂枝药对活性成分作用靶点与化疗引起的神经毒性靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram of targets of active ingredients of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus and neurotoxic targets caused by chemotherapy

2.3 黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性潜在作用靶点的PPI 网络的构建

将242 个黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性的潜在作用靶点输入STRING 数据库，由于有13 个潜在作用靶点与其他靶点之间不存在相互作用关系，最终得到229 个潜在作用靶点参与的PPI网络，含229个节点、2207条边。采用Cytoscape 3.2.1软件中CytoNCA 插件筛选出度值＞30 的潜在核心靶点46 个，核心子网络见图3，含46 个节点、599条边。节点分别代表潜在作用靶点，节点大小与颜色代表靶点的度值，节点越大、颜色越深，表明靶点在网络体系中的度值越大；节点间连线表示靶点间存在潜在的相互作用关系。

图3 黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性潜在作用靶点的PPI 网络Fig.3 PPI network of potential targets of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus for preventing and treating neurotoxicity caused by chemotherapy

2.4 黄芪-桂枝药对活性成分-靶点-疾病网络构建

将46 个潜在核心靶点及其对应的29 个活性成分输入Cytoscape 3.2.1软件，构建黄芪-桂枝药对“活性成分-靶点-疾病”网络见图4，菱形代表黄芪-桂枝药对潜在活性成分，圆形代表潜在核心靶点，节点间的连线代表二者间的对应关系，连线越多的活性成分或靶点代表其在网络中的作用越关键。

图4 “活性成分-靶点-疾病”网络Fig.4 “Active ingredient-target-disease” network

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

对46 个潜在核心靶点分别进行GO 功能和KEGG 通路富集分析，选取P＜0.05 且排名前10的条目，生物过程（biological process，BP）富集结果见图5，黄芪-桂枝药对防治神经毒性可能与影响基因转录与表达、针对细胞凋亡的负面调控（即抑制凋亡）、针对药物反应、信号转导、促进细胞增殖、调节一氧化氮（nitric oxide，NO）生物合成过程等过程密切相关。分子功能（molecular function，MF）富集结果见图6，黄芪-桂枝药对防治神经毒性可能与影响蛋白质结合、酶结合、转录因子结合、DNA结合、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）结合、染色体结合、转录因子的活性及DNA 序列的特异性结合、丝裂素活化的蛋白激酶活性等功能密切相关。KEGG 通路富集结果见图7，黄芪-桂枝药对防治神经毒性可能与影响肿瘤相关通路、乙型肝炎相关通路、磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide-3 kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信号通路、甲型流感病相关信号通路、缺氧诱导因子信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）通路、人嗜T-淋巴病毒1 型（human T-cell lymphoma-leukemia virus-1，HTLV-1）感染疾病相关通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、Toll 样受体信号通路等密切相关。

图5 黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性潜在核心靶点的GO-BP 富集分析(前10)Fig.5 GO-BP enrichment analysis of potential core targets of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus on preventing and treating neurotoxicity caused by chemotherapy(top 10)

图6 黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性潜在核心靶点的GO-MF 富集分析(前10)Fig.6 GO-BP enrichment analysis of potential core targets of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus on preventing and treating neurotoxicity caused by chemotherapy(top 10)

图7 黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性潜在核心靶点的KEGG 通路富集分析(前10)Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis of potential core targets of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus on preventing and treating neurotoxicity caused by chemotherapy(top 10)

3 讨论

恶性肿瘤已成为全球性的多发疾病，化疗、放疗、手术治疗为恶性肿瘤常用的治疗手段[11-12]。奥沙利铂[13]是胃肠道恶性肿瘤化疗的一线用药，与其他铂类药物相比，其骨髓抑制、胃肠道反应等不良反应较轻，且对心肾无影响，但神经毒性较明显。奥沙利铂诱导的癌性神经病理性疼痛的发病率高且病程持续时间长，严重影响患者生活质量及化疗的连续性[14-16]。目前西医多采用维生素、硫辛酸、腺苷钴胺、甲钴胺等治疗化疗后继发性的神经毒性，但疗效一般。外周神经毒性归属于中医学中“血痹”“痹症”“麻木”等范畴，临床治疗以补气活血、化瘀通痹、益气养阴为主要原则[17-18]。黄芪桂枝五物汤出自《金匮要略》，由黄芪、桂枝、芍药、生姜、大枣5 味中药配伍而成，其中黄芪补气固表、托毒排脓，桂枝发汗解表、散寒止痛，芍药镇痉通经，生姜温中止呕、解表散寒，大枣补脾和胃、益气生津，全方具有益气温经、和血通痹的功效。肢体血流量减少、局部血液循环障碍、肌肉失养均可导致肢体麻木，黄芪、桂枝可以扩张血管以改善末梢血供，从而调整和促进肢体血液循环。

本研究通过网络药理学方法合并文献挖掘，共筛选得到黄芪-桂枝药对潜在活性成分38 个，其中MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山柰酚）、MOL000401（黄芪皂苷I）、MOL000403（黄芪皂苷II）、MOL000398（二氢异黄酮）、MOL000392（刺芒柄花素）、MOL004576（花旗松素）对应疾病靶点的数目较多。研究发现，槲皮素可以有效缓解中枢神经系统退行性病变，对脑缺血、阿尔茨海默病、帕金森病等多种中枢神经系统疾病均有一定的防治作用[19]；槲皮素具有抗炎、抗癌、抗氧化、改善内皮功能、防止血小板聚集、提高人体免疫力等作用[20-22]。山柰酚对多种损伤组织均具有保护作用，山柰酚可以降低慢性低灌注大鼠脑额叶胶质纤维酸性蛋白表达，抑制β-淀粉样前体蛋白表达及在胼胝体的聚集，从而发挥对慢性脑缺血星形胶质细胞和轴突的保护作用[23]。黄芪总皂苷能够明显改善脑出血后脑水肿大鼠模型神经功能，下调B 淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2），上调Bcl-2 相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）及其下游半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3），从而发挥抗神经元凋亡、保护神经的作用[24]。芒柄花素具有抗肿瘤、调血脂、抗心律不齐、抗菌、解痉挛、抗脂质过氧化等作用，能够改善动脉粥样硬化病变[25-26]。由此可见，黄芪-桂枝对化疗引起的神经毒性具有潜在的防治作用。黄芪主要含皂苷类、黄酮类和多糖类成分，具有增强心肌收缩力、抗心律失常、降血压、降低血小板黏附力、减少血栓形成、调血脂、抗衰老等作用；桂枝主要含有机酸类和挥发油类成分，具有健胃、缓解胃肠道痉挛、利尿强心、镇痛镇静、抑制惊厥等作用。“活性成分-靶点-疾病”网络显示黄芪-桂枝药对防治化疗引起的神经毒性具有多成分、多靶点的特点。

本研究筛选得到与药物治疗疾病密切相关的46 个潜在核心靶点，分别为肿瘤抗原p53（tumor antigen p53，TP53）、AKT1、MAPK1、信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、MAPK8、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、TNF、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）等。上述核心靶点与肿瘤相关信号通路联系密切，其中最典型核心靶点为TP53、AKT1。损伤性因子和谷氨酸盐诱导的神经元死亡与TP53的表达有关[27-28]；TP53 在缺血和兴奋性损伤诱导的神经元细胞凋亡过程中发挥关键性作用[29]。AKT1是P13K/AKT 通路的重要组成部分，在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK-1）的辅助下，P13K 磷酸化AKT 蛋白的Thr308 和Ser473 位点，活化的AKT通过上调细胞周期蛋白1（Cyclin D1）、磷酸化p21和p27 等蛋白表达，促进细胞增殖，并抑制细胞凋亡[30-31]。因此，黄芪-桂枝药对可能通过调控TP53和AKT1 来防治化疗引起的神经毒性。

综上所述，本研究通过网络药理学方法结合传统中医理论，发现黄芪-桂枝药对能够通过影响基因转录与表达、促进细胞增殖等过程，作用于肿瘤相关通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路等防治化疗引起的神经毒性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突